美容护肤界的新兴明星

作者：张馨予

女性到30岁，内心最大的矛盾便是脸部日渐增多的皱纹、细纹、眼角纹、鱼尾纹、法令纹等。为了自己的容貌不被改变，为了让自己脸部尽显青春。市面上各种各样的抗衰需求也越来越多，如：水光针、玻尿酸甚至是干细胞美容，大家都勇于“尝鲜”。而作为美容护肤界的后起之秀——“外泌体”，大家更是不愿错过。毕竟它虽然是近几年兴起的美容新兴模式，但外泌体的研究历史也已经有40多年了，而它的美容功效更是皆有口碑，比干细胞美容有过之而无不及，一时间，关于外泌体美容的宣传铺天盖地，可谓是风头无两，颇有“大佬”的地位。但也正因为如此，我们更要科学严谨的对待外泌体美容，了解它的原理，才能更好的应用它。

外泌体是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡 (30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。

美容护肤界的新兴明星

外泌体最大的功能便是人体细胞间的“通信员”，它能在细胞间传递物质，从而调控受体细胞的功能及生物学行为。通俗的说，外泌体就好像一辆“细胞快递哥”，装了自家一堆有用的东西（里面有miRNA，mRNA和lncRNA等小分子核酸，还有细胞因子等蛋白），然后分泌出细胞外，再接着进入另一个细胞，进行“快递运输”。

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外泌体是胞内体逆出芽形成多囊泡胞内体，多囊泡胞内体与细胞膜融合，向细胞外释放形成外泌体。几乎所有的细胞都可以分泌外泌体其存在于大多数种类的细胞和多种体液当中，同时也存在于大多数种类细胞的培养液中。

今天就来给大家普及一下外泌体研究中的第一步：如何高效分离外泌体？

1.超速离心法

超速离心法是目前最常用的外泌体纯化手段，通过高速离心将大小相同的囊泡从样本中沉淀并纯化出来。外泌体超速离心一般和蔗糖密度梯度离心或蔗糖衬垫组合起来分离低丰度外泌体。需在离心机中以100,000-200,000 x g离心沉淀（含有外泌体）120分钟，使样品中的外泌体在1.13-1.19g/mL的蔗糖密度范围内进行富集。

尽管这种联合的方法可以获得高度纯化的外泌体，但也存在一些缺点。例如同批次最多只能同时处理6个样本（转子限制）且回收率不稳定，前期需要准备大量材料且外泌体得率低。最重要的是重复离心很可能对外泌体的囊泡造成损害从而降低其质量，并且一些可溶性蛋白可与外泌体形成团块而产生污染。

2.超滤离心法

超滤离心法是利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超滤膜进行选择性分离，小分子物质会被过滤到膜的另一侧，而大于膜孔径的高相对分子质量物质则截留在超滤膜上。

这种方法比较简单高效，也不影响外泌体的生物活性，但缺点是外泌体可能会阻塞过滤孔，导致膜的寿命减短，分离效率较低。此外，截留在膜上的外泌体间也会发生粘附，导致产量降低。

Tips：外泌体是直径30~100 nm囊状小体，大于一般蛋白质。采用此方法需要考虑到与外泌体大小相似的其他囊泡的干扰。

3.磁珠免疫法

外泌体表面有其特异性标记物（如CD9，CD81，CD63，CD82，Hsp70，Ras相关蛋白Rab-5b，细胞骨架蛋白肌动蛋白和TSG101等），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。因为外泌体的异质性与它们的起源一致，不同外泌体上的标记物丰度也不同，通过特定的抗体组合可以从样本中捕获不同类型的外泌体，进行选择性分离。

磁珠法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验，难以广泛普及。

4.PEG-base沉淀法

聚乙二醇（PEG）可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早期应用于从血清等样本中收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。在4℃利用PEG孵育后通过过滤或离心即可沉淀、回收外泌体。

采用此种分离方法也存在不少问题：纯度和回收率低，杂蛋白较多（假阳性），颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温-20等化学添加物将会破坏外泌体等，因此发表文章时易受质疑。

5.其他方法（文献报道）