细胞凋亡检测实验

作者：张馨予

细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合（主要结合于A-T）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。

一、试剂准备

1. 三尖杉酯碱（HT）：300μg/ml；

2. Tris-HCl（pH7.5）：100mmol/L；

3. EDTA缓冲液：5mol/L；

4. 碱性裂解液：0.2mol/L NaOH；

5. 醋酸钠：3mol/L KAc（pH4.8）；

6. PI母液：500μg/ml；

7. Ho33342母液：2mmol/L；

8. 人早幼粒白血病HL-60细胞：用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37℃，5% CO2条件下培养。

9. 其他：异丙醇、1%SDS、70%乙醇、溴酚蓝、蔗糖指示剂、TBE电泳缓冲液、1%琼脂糖、溴乙锭。

二、三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡

1. 实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记①、②，每瓶含约6 ml培养液，置37℃，5%CO2培养箱培养。

2. 实验前约2.5小时，当细胞密度达到70%，①号瓶加入三尖杉酯碱200 μl，使终浓度为1 μg/ml，②号瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。

3. Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞

（1）染色：将瓶中的细胞摇匀取200 μl于1.5 ml的离心管中，加入Ho33342母液2 μl，PI 20 μl，染色15分钟。

（2）滴片：取一载玻片用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10 μl，加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外激发光，高倍镜下观察，区别三种细胞，并注意三者比例。

注意事项

1. 诱导培养HL-60细胞时间要准确；

2. 荧光显微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。

Ausbian®特级胎牛血清所有血清出厂前，均经过严格质控，每个批次附有详细完整的《检测报告》，包括：品名，货号，批号，血源地，生产日期，保质期，pH值、渗透压、血红蛋白、总蛋白、球蛋白、IgG、内毒素、无菌检查（细菌、真菌、支原体）、病毒检查（如BVD、牛腺病毒、细胞病变效应等）、促细胞生长能力、细胞毒性、BVD-1/2抗体检查等。

实验人对于新批次血清，应认真审阅《检测报告》，做好试用前筛选第一步。（如何看懂《检测报告》，可登陆“缔一生物”网站，留言技术部，得到免费帮助。）

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