真菌的检验方法 技术前沿 中国标准物质网
（一）标本直接检查
1．直接镜检 直接镜检对真菌病的诊断较细菌更为重要。
1)不染色标本的检查许多真菌标本不需染色即可直接镜检。若发现真菌菌丝和抱子，则可初步判定为真菌感染。如癣病标本多用KOH湿片检查法。即取病发或病损部位皮屑、甲屑置于载玻片上，加1滴10％～20％KOH溶液，然后加盖玻片并微微加热，使标本组织溶解透明，镜检观察真菌的菌丝和孢子。
2)染色标本的检查标本经染色后镜检既可以更清楚地观察真菌的形态和结构，又可提高检出率。根据菌种和检验要求不同而选用不同的染色方法。常用的真菌染色方法如下。
(1)革兰染色法：各种真菌均为革兰阳性，为蓝紫色，常用于酵母菌、白假丝酵母菌及组织胞浆菌等的染色。具体染色方法同细菌的革兰染色法。
(2)乳酸酚棉蓝染色法：适用于各种真菌的直接检查，培养物涂片检查及小培养标本保存等。如皮肤癣菌的检查。取洁净的玻片一块，滴加一滴乳酸酚棉蓝染液，将被检真菌放于染液中，加上盖玻片（加热或不加热）镜检。
(3）墨汁负染色法：多用于脑脊液标本中新生隐球菌的检查。取一滴优质墨汁置干载玻片上与被检标本混合，盖上盖玻片镜检。
(4)糖原染色法：又称过碘酸Schiff染色法（简称PAS或PASH)。可用干标本直接涂片及组织病理切片染色检查，其原理是真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖，过碘酸使糖氧化成醛，再与品红-亚硫酸结合，成为红色，故菌体均被染成红色。组织内的糖原亦被染成红色，但因组织内的糖原经淀粉酶消化后消失，此点可鉴别两者。染色方法：①组织切片先用二甲苯脱蜡及95％乙醇逐级脱水，如标本为直接涂片则可从下一步开始；②浸于过碘酸溶液5 min,蒸馏水冲洗2 min;③将标本片再浸入碱性复红溶液中15 min，之后用自来水冲洗直至切片发红；④亮绿复染5 S;⑤ 95％乙醇脱色1次，再用100％乙醇脱色2次，用二甲苯脱色2次；⑥封片，镜检。染色结果：真菌及组织内的多糖成分均呈红色，核为蓝色，背景为淡绿色。
(5）荧光染色法：染色方法有直接涂片、培养物涂片及组织切片3种。常见深部真菌的荧光反应见表28-2。
表28-2常见深部真菌的荧光反应
3)直接镜检注意事项
(1）阴性结果不能排除真菌感染，故可疑结果应复查或采用其他检验方法鉴定。
(2)可出现假阳性结果。如溶解的淋巴细胞在脑脊液墨汁负染色检查中易被误认为新生隐球菌；脂肪微滴也可与出芽酵母菌混淆。
(3)注意与其他混杂物加以区别，真菌抱子、菌丝、菌体都有一定的形态结构，而混杂物形态多样。
(4)要区分皮肤上的致病菌和腐生菌，腐生菌菌丝不附着在皮肤上而是游离的，菌丝、抱子为棕褐色，菌丝特别粗。
（5）注意与显微镜镜头、载玻片、盖玻片上长的霉加以区别。
2.抗原检测采用免疫学方法检测真菌抗原，常用的方法有乳胶凝集试验、ELISA,半定量放射免疫测定法。用乳胶凝集试验检测标本中的白假丝酵母菌甘露聚糖抗原；用乳胶凝集试验和ELISA快速检测患者血清和脑脊液标本中的新生隐球菌荚膜多糖抗原，特别在治疗前检测非常敏感、特异；用半定量放射免疫测定法检测血清、尿液和脑脊液标本中的荚膜组织胞浆菌循环多糖抗原，可快速诊断。所有检测方法均应设阳性和阴性对照，以防止假阳性和假阴性的发生。
3．核酸检测随着分子生物学的日益发展，在医学真菌的鉴定手段中不断引入了分子生物学的鉴定方法，从核酸GEC的摩尔分数分析、限制性片段长度多态性分析、Southern印迹分析到脉冲场凝胶电泳分析、PCR指纹分析、随机扩增多态性DNA分析等。分子生物学技术虽具有操作简便、敏感性和特异性高的优点，但需要一定的实验条件，并大多仍处于实验研究阶段，故目前不可能完全替代常规鉴定方法，仅是真菌鉴定的有效补充，尤其对一些疑难、特殊或高度变异的菌种鉴定及深部真菌感染的早期诊断，不失为具有广阔发展前景的诊断新技术。
（二）真菌的分离培养
真菌培养的目的在于真菌的鉴定，真菌的培养方法与细菌相似。
1．培养基根据真菌对营养要求的差异及培养目的的不同而选择不同的培养基。常用的真菌培养基及其用途见表28-3
表 28-3常用的真菌培养基及其用途
2．培养方法
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