案例分享，手把手教你液相色谱梯度优化

作者：张馨予

各位小伙伴在实验分析中应该都遇到过这类问题，在液相色谱中，对于组分复杂的样品，采用一种色谱体系，往往很难得到理想的分离效果，要么分离时间太长，要么分离度太差。这种情况，采用梯度洗脱就可以缩短分析时间，提高分离效果。下面和大家分享一则梯度微调实例，一起感受下梯度微调对分离效果的奇妙影响吧。

1、尽量在能长时间测试该项目的仪器上开发方法；

2、需要了解系统的性能，避免出现仪器系统改变后不能重现的问题；

3、要知道系统的两个基本情况：梯度滞后体积和比例精确性。这可以在同一个实验里得到这两个数据：参考《JJG 705 2014液相色谱仪检定规程》中《梯度误差》实验：在B溶液（0.1%丙酮）后加紫外检测器，设置一个多阶层的梯度，B溶液以5%的幅度从0%变到100%，流速与平常一样，流速为1mL/min。每段梯度大概保持5min。然后接二通运行梯度，记录图谱。每段梯度设置的时间与实际发生的梯度时间之差就是梯度延迟时间，阶层的高度可以用来测量流动相比例，这些阶层可能有点模糊，是由系统中混合体积造成的；

4、检测完系统，就可以按照它的性能来设计方法。梯度方法转换大的问题是梯度滞后体积，如果知道仪器的滞后体积比初开发方法的仪器大，就要自觉的在方法前加一段等度来抵消这一差别，如果目标系统滞后体积小，就要在转移方法的时候在方法开始加一段梯度延迟时间，如果比例差别是在梯度运行中间出现的，也可以通过调节梯度图谱来抵消这种差别，但是一般很少遇到过需要这么做的情况。

5、初始流动相没有充分平衡。柱子已经用初始流动相平衡了，但在分析中，梯度变化很快，而柱子没有用初始流动相充分平衡好，这样di一针时总是与后面的不一样。但是如果转移到有不一样滞后体积的系统时，可能就是另一种情况。

项目背景

名称：12种酚类

色谱柱：月旭Ultimate ® AQ-C18 4.6mm*150mm,5μm

流动相A：水 流动相B：乙腈

案例分享，手把手教你液相色谱梯度优化

问题：柱子正常活化进样，基线和整体出峰均不理想，分离度较差。

案例分享，手把手教你液相色谱梯度优化

1.柱子在运输或储存过程中保存液发生变化，导致填料产生微小改变，碳链蜷缩，未舒展开来，对目标物的保留造成影响；

2.仪器系统存在梯度滞后，在梯度变化过程中，两相混合不精准，导致的物质分离问题；

3.目标物受溶剂效应影响；

4.梯度变化过快，流动相的洗脱能力太强，导致色谱峰未达到分离效果。

1.测试梯度滞后体积和比例精确性；

2.用初始流动相0.2流速过夜平衡柱子；

3.样品用初始流动相溶解（慎用，改变样品溶剂后需要验证样品溶液的稳定性）；

4.调节梯度，减缓洗脱速率，减小洗脱能力；

案例分享，手把手教你液相色谱梯度优化

基线和峰形大有改善，但是后一个峰在梯度时间外出峰了。

梯度变化中，水相速率增长较快，物质保留变强，没有获得足够的洗脱能力，后一个物质出峰较晚。

前段分离好的梯度不做调整，调整后一个物质出峰梯度阶段的有机相比例，增加洗脱能力。

案例分享，手把手教你液相色谱梯度优化

以上说明，项目的成功与否，不仅取决于色谱柱类型，仪器条件，还有方法的建立。其中流动相便是考察重点，流动相梯度洗脱必要时可以充分应用上，他是由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中不同时间段各溶剂组成的比例改变流动相极性，使每个流出的组分都有合适的容量因子，并使样品的所有组分在短时间内实现佳分离。好啦，今天的分享就先到这，希望能对小伙伴们有所启发有所帮助哦。