快速检测转基因植物中CP4

作者：张馨予

快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法与流程

本发明涉及转基因油菜、大豆等作物的谷物散粮及其粗加工产品中的蛋白CP4-EPSPS的快速检测方法，属于转基因检测领域。

背景技术：

随着各种各样的转基因食品大量涌入市场，转基因食品的安全性日益备受关注，世界各国对转基因食品的安全性存在较大的争议。欧盟，日本等地区已制定相关法规对转基因食品进行严格的管理。因此，快速检测转基因作物/植物中转基因蛋白的方法具有重要的意义。

自1996年孟山都(Monsato)公司上市第一例抗草甘膦大豆一来，转基因作物的推广应用经历了18年，抗除草剂性状仍然是转基因植物的首要性状。CP4EPSPS被应用于多种作物的转基因研究中，包括玉米、大豆、棉花、油菜、甜菜和苜蓿等。

随着各种各样的转基因食品通过贸易大量进入国际市场，转基因食品的安全性受到人们的日益关注，世界各国对转基因食品的安全性存在着较大的争议，欧盟、日本等地区已经制定了相关法规对转基因食品进行了严格的管理。因此，检测转基因作物/植物中转基因蛋白的定量技术逐渐成为研究热点之一。

5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)是莽草酸合成途径中的关键酶，能够催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与莽草酸-3-磷酸(SP3)生成5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)，为芳香族氨基酸的合成提供前提物质，该酶广泛存在于微生物和高等植物体内。除草剂草甘膦的靶标酶即为EPSPS。来自根癌农杆菌CP4菌株的EPSPS对高浓度的草甘膦表现出非常高的抗性，从此，该基因被广泛用于多种转基因作物中。

目前常用的CP4-EPSPS检测方法包括基于DNA的PCR检测方法及基于蛋白质的酶联免疫吸附法。PCR法能够从作物种子开始到作物成熟整个过程中对转基因成分进行精确检测，不受样品的处理方法的影响，但易出现假阳性和假阴性等问题，且因经高度处理过的转基因产品及其衍生物，如植物油、糖或者淀粉等中不含任何DNA成分，因此PCR方法无法实现对此类转基因食品的检测。酶联免疫吸附法可对样本进行批量处理，但其耗时较长，需要专业技术人员，且需特殊的仪器，因此该种检测方法不利于在无相关专业技术用户市场的推广和使用。本发明采用胶体碳免疫层析技术，可实现快速检测，肉眼即可进行判断，无需专业技术人员的便于推广的目的。

技术实现要素：

针对上述情况，本发明提供一种利用胶体碳建立的快速检测转基因作物(油菜、大豆等)的谷物散粮及其粗加工产品中的CP4-EPSPS的检测试纸条，采用标记了兔多克隆抗体E01的胶体碳垫与包被了兔多克隆抗体C01的硝酸纤维素膜(检测线)和包被了羊抗兔IgG的硝酸纤维素膜(质控线)制成硝酸纤维素膜配合；采用双抗体夹心免疫层析的原理，样本中的抗原在侧向移动的过程中与胶体碳标记的特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，继续向前方流动和硝酸纤维素膜的检测线上特异性抗体结合形成双抗体夹心复合物进而形成肉眼可见的条带而进行结果的判定，它具备操作简便，迅速，反应灵敏度高，成本低以及便于大规模推广使用的优点。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

快速检测转基因植物中CP4-EPSPS的方法，包括以下步骤：

步骤一，胶体碳的制备；

步骤二，适合PH值条件下胶体碳标记抗体的制备；

步骤三，抗体包被至反应膜作为T线及二抗包被至反应膜的C线；

步骤四，胶体碳试纸条的制备；

步骤五，从待检植物中提取蛋白，制备蛋白提取液；

步骤六，将检测试纸条插入蛋白提取液中反应；

步骤七，适当反应时间后，进行肉眼判断结果。

优选的，步骤二中所述抗体为兔抗CP4-EPSPS多克隆抗体；优选的，步骤二中PH值为8～10，最优选的PH值为9.0。

优选的，步骤三中所述抗体亦为兔抗CP4-EPSPS多克隆抗体。

优选的，步骤三中抗体包被量为100ug/1ml碳。

优选的，步骤三中所述二抗为羊抗兔IgG抗体。

优选的，步骤六中所述反应温度为10℃～30℃，更优选15℃-25℃。

优选的，步骤七中所述反应时间为3-15分钟，更优选5-10分钟。

本发明的优点是：采用胶体碳免疫层析技术，可实现快速检测，肉眼即可进行判断，无需专业技术人员的便于推广的目的。采用胶体碳检测试纸条，制备出表面带有游离氨基基团的胶体碳纳米颗粒，胶体碳相对胶体金具备一系列优越性：胶体碳较胶体金更易制备，更易实现规模化生产且批间差小；胶体碳黑白信噪比更高，而胶体金红白对照不易辨别且易受全血检测的影响；检测动力学范围更广，大大降低了胶体金易出现的HOOK效应的可能性；较胶体金更稳定，可于室温下保存更久；固态碳对环境友好，避免了胶体金技术出现的环境重金属污染的情况。快速检测转基因植物中转基因蛋白采用双抗体夹心免疫层析的原理，样本中的抗原在侧向移动的过程中与胶体碳标记的特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物，继续向前方流动和NC膜检测线上特异性抗体结合形成双抗体夹心复合物进而形成肉眼可见的条带而进行结果的判定。