不同发育期新疆库尔勒香梨转录组学研究: 挖掘

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

Introduction

库尔勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yü）是我国新疆维吾尔自治区的特色梨种，国家地理标志产品，其果实因具有色泽悦目、味甜爽滑、香气浓郁、皮薄肉细、酥脆爽口、汁多渣少、落地即碎、入口即化、耐久贮藏、营养丰富等特点，其可食部分占83.6%，含糖10%，酸0.03%，富含维生素、绿原酸等植物化学素及多种微量元素，被誉为“梨中珍品”，深受国内外消费者的欢迎。

绿原酸（Chlorogenic acid, CGA）植物主要次生代谢物之一及抗氧化物质，由葡萄糖经过一系列酶促反应生成。它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤及抗氧化等多种生物活性，特别是可以预防与氧化应激相关的各种疾病，近年来发现CCA复合物可以诱导人结肠癌HCT-116细胞死亡，因此 CGA作为梨果中的重要特征性多酚得到重点关注。

我国科学家在2013年报道了全球首个梨—砀山酥梨（P. bretschneideri）基因组；中国农业科学院果树研究所于2019年在线发表了山西杜梨（P. betuleafolia）—世界上首个野生梨高质量基因组图谱。转录组学是研究植物生长与基因表达关系的有效方法，目前基于转录组学技术对梨果实品质及功能性成分的研究已成为果树育种的新趋势。如王大玮等进行了云南特色梨果“火把梨”转色前后的转录组学分析，筛选出30 个参与花青素生物合成的差异表达基因。戴美松以砂梨新品种“翠玉”和主栽品种“翠冠”为材料鉴定出山梨醇生物合成的关键基因。

新疆幅员辽阔，具有丰富的梨树种质资源和广阔的梨园种植面积，梨果年产量稳居全国各地区前列，具有优越的环境与物种条件进行梨果的改良育种。但是目前新疆梨果育种研究主要仍停留于传统技术，如抗虫害、发育期改良、增加产量等栽培特性上。随着人们生活水平的提高，食物营养健康价值越来越受重视，提高梨果的营养健康价值，特别是梨果中的绿原酸含量正成新的育种方向。

浙江大学生物系统工程与食品科学学院硕士研究生文豪、沈立荣教授*，塔里木大学吴翠云教授*等在本文以新疆库勒香梨为研究对象，检测了不同发育期梨果的发育性状、绿原酸含量的差异，并采取无参转录组学分析，进行了梨果中绿原酸生物合成途径的关键酶基因挖掘，为新疆地区特色梨果的功能性育种提供了理论依据。

Results and discussion

不同发育期梨果中绿原酸含量的变化趋势

从新疆阿拉尔市塔里木大学果园采集库尔勒香梨，采用随机设计，于花后58 d（58 DAFB）开始采样，每隔15 d定期定点采集梨果，采摘后对果实拍照、称单果，用刀片切横切面（包括果皮、果肉和果核），冷冻干燥、打粉。

由图1可见，在58DAFB到163DAFB发育期间，库尔勒香梨逐渐形成两头窄中间宽的纺锤形状，表皮颜色由翠绿色转为阳面为红，阴面为绿的混合颜色，最终在成熟时变为淡黄色。根据其单果重的增长趋势，梨果发育期可分为幼果期（58 ~ 88 DAFB, T1）、膨大期（88 ~ 148 DAFB, T2）和成熟期（148 ~ 163 DAFB, T3）。幼果期单果重变化趋势较为平缓，在膨大期单果重迅速增加，随着梨果发育成熟单果重逐渐趋于稳定。

图1 库尔勒香梨梨果单果重变化趋势

CGA与熊果苷是梨果中最主要的酚类物质。采用液相色谱法（HPLC）对库尔勒香梨各个发育阶段的CGA与熊果苷含量进行了分析。随着果实的生长发育，梨果绿原酸含量呈下降趋势。CGA在T1、T2、T3的含量分别为（20.96 ± 1.84）, （12.01 ± 0.91）和（7.16 ± 0.41） mg/100 g 。

转录组测序数据组装、功能注释

选择T1、T2和T3梨果样（液氮保存）分别提取RNA，进行Illumina二代测序、得到的RNA-Seq数据用于构建库尔勒香梨无参转录组Unigene数据库，Unigene功能注释及表达量分析，根据Unigene表达量筛选差异表达基因及功能富集分析，最终根据分析结果筛选与绿原酸生物合成相关的关键基因。对全部高质量clean reads进行Trinity组装结果，共得到119 340条Transcript。取每个基因最长的Transcript为Unigene，获得68 059条Unigene，样品clean reads与Unigene平均比对率为83.57%。

将组装得到的Unigene与六大公共数据库（GO、KEGG、COG、NR、Swiss-Prot和Pfam）进行比对。注释统计结果（表1），共有39 298条Unigene获得注释，占Unigene总数的57.74%。其中注释到NR数据库的Unigene最多为38 184，占Unigene总数的56.10%；其次是GO数据库（25 691，37.75%）和Swiss-Prot数据库（25 381，34.13%）；获得注释数最少的是KEGG数据库（15 780，23.19%）。总体上该组装的注释信息较为丰富。