ADAR1掩蔽了由ZBP1驱动的程序性坏死在肿瘤免疫治

作者：杨超月

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重新激活内源性逆转录病毒元件（ERE）能够刺激体内固有免疫并增加肿瘤对免疫治疗的敏感性。ADAR1蛋白的功能就是防止内源性逆转录病毒元件激活机体免疫应答【1】。ADAR1有三个重要的结构域，分别是：识别并结合左手螺旋核酸（Z-RNA/Z-DNA）的结构（Zα）；识别并结合右手螺旋RNA（A-RNA）的结构（dsRBDs）；以及脱氨基酶结构（deaminase）（图1）。通常，形成双链的内源性逆转录病毒元件RNA以右手螺旋形式存在，并会激活由双链RNA受体（MDA5等）介导的干扰素（interferon）信号通路，进而增强肿瘤对免疫治疗的反应。而ADAR1蛋白会通过dsRBDs结合右手螺旋的双链RNA并对其进行编辑（A to I editing），导致双链结构紊乱，从而防止其被MDA5等识别【2】。

图1. ADAR1的结构

另一方面，ADAR1也具有识别左手螺旋核酸的Zα结构域，是否ADAR1也能够结合左手螺旋核酸并对其编辑从而防止其激活下游信号通路？

2022年5月25日，来自Fox Chase Cancer Center的Balachandran教授以及张霆博士，尹超然博士在Nature上发表了文章ADAR1 masks the cancer immunotherapeutic promise of ZBP1-driven necroptosis，发现缺失ADAR1以后，产生的内源性Z-RNA会活化左手螺旋核酸受体ZBP1，并诱导ZBP1依赖的细胞程序性坏死。程序性坏死会释放大量损伤相关分子模式（DAMPs）【3】，并强烈刺激免疫系统从而极大改善肿瘤对免疫治疗的抵抗【4】。

首先，作者发现，当在小鼠胚胎成纤维细胞中敲除ADAR1以后，经过4-7天的培养，就能在细胞中检测到内源性Z-RNA，并且这些Z-RNA的产生依赖于干扰素信号通路。并且，当直接在ADAR1缺失的细胞中加入重组干扰素蛋白也会强烈地诱导Z-RNA产生。通过运用特异识别左手螺旋核酸的抗体进行免疫功沉淀测序（RIP-seq），作者鉴定出内源性的Z-RNA主要是干扰素刺激基因（ISG）的mRNA。这些Z-RNA包含两大类，分别是：1. 在3端非编码区有正向和反向的short interspersed nuclear elements （SINE）；2. 在3端非编码区富含GA重复序列（GA-type simple repeat）。其中，ADAR1的编辑位点主要集中在由正反向SINE形成的Z-RNA。GA重复序列通过折叠形成类似于哑铃状结构（dumbbell RNA）。通过人工合成dumbbell RNA，也确实观察到在高盐浓度条件下，RNA形成左手螺旋。但是，作者几乎没有发现在GA重复序列 Z-RNA上有ADAR1编辑位点。此外，通过荧光染色发现，即使突变ADAR1的deaminase，也不能完全达到ADAR1敲除所产生的Z-RNA信号强度；而使用蛋白酶进行适当消化以后，Z-RNA的信号就能恢复到如ADAR1敲除一样。因此，作者合理推测：ADAR1除了通过A to I的编辑解除左手螺旋，还可以直接结合在Z-RNA上将其掩盖而不被其他Z-RNA受体（或者抗体）所识别。

识别左手螺旋核酸的另外一个重要蛋白ZBP1可以介导RIPK3-MLKL依赖的程序性坏死（necroptosis）。当细胞中表达完整的程序性坏死通路蛋白（ZBP1，RIPK3以及MKL），同时敲除ADAR1以后，就会引发细胞死亡。这种ADAR1缺失引起的程序性坏死能够被ZBP1敲除或RIPK3抑制剂所恢复。并且，作者通过Duolink PLA技术也证明ZBP1识别并结合了内源性Z-RNA分子，这种结合是依赖于ZBP1自身的Zα结构域。综上所述，ADAR1通过dsRBD结构域防止A-RNA激活受体MDA5/PKR，并导致干扰素产生以及翻译停滞；ADAR1也通过Zα结构域阻止Z-RNA激活ZBP1介导的程序性细胞坏死（图2）。

图2. ADAR1抑制内源性A-RNA和Z-RNA，以防止下游受体被激活。

目前，由于缺乏临床适用的ADAR1抑制剂，如何干扰ADAR1的功能从而解除对Z-RNA的限制是亟待解决的难题。由于左手螺旋RNA（Z-RNA）和左手螺旋DNA（Z-DNA）结构非常相似，而ZBP1又能识别这两种左手螺旋核酸。因而，作者思考能否用Z-DNA来模拟ADAR1缺失所产生的Z-RNA。通过对DNA结合分子，拓扑异构酶抑制剂，重塑染色质结构分子等等进行筛选，作者鉴定出一个小分子化合物CBL0137能够强烈诱导基因组DNA转变为左手螺旋【5】。通过使用识别Z-DNA的抗体进行ChIP-seq分析，作者发现，CBL037所诱导的Z-DNA主要是位于基因间的long interspersed nuclear elements（LINE）。其中绝大部分是L1Md A 和L1Md T的5端非编码区序列。这些DNA序列富含GC（Z-prone DNA），本身具备形成左手螺旋的潜力。与Z-RNA类似，CBL0137所诱导形成的Z-DNA也能激活ZBP1依赖的细胞程序性坏死。并且，经过比对分析，作者发现，大部分由ZBP1共沉淀的DNA确实是Z-DNA抗体所结合的序列，这些DNA序列高度重合于L1Md A 和L1Md T的5端非编码区。综上所述，作者得出结论，小分子化合物CBL0137滲入基因组DNA，将LINE-1（L1Md A 和L1Md T）5端非编码区的Z-prone DNA转变成左手螺旋从而在细胞核里激活ZBP1依赖的程序性坏死（图3）。