哺乳动物细胞双杂交简介

作者：张馨予

哺乳动物细胞双杂交分析是一种用来研究体内蛋白质相互作用的方便而有效的工具。这种方法比起大家所熟知的酵母双杂交分析的一个主要优点是，它可用于研究酵母内没有正确折叠，或者是酵母内通常不存在、需要翻译后修饰或外来刺激才表达的蛋白质之间的相互作用。

哺乳动物双杂交分析类似于众所周知的酵母双杂交分析，从原理上讲，这两种方法都是基于这样一个事实，即许多真核细胞的转录激活子都由两个在实质和功能上都独立分开的模块组成:一个是DNA结合域(DNA-binding domain, DBD,图1中的“D")，它可特异性结合到一个启动子/增强子元件上;另一个是转录激活功能域(transcriptional activation domain, TAD,图1中的“A”)，它可指导RNA多聚酶Ⅱ去转录DNA结合位点下游的基因。对于一个天然的转录因子来说，成功的转录激活需要这两个功能域的共同参与(图1Ⅰ)。相比之下，如果TAD不能与DBD结合到启动子上，这两个结构域的独立表达并不会激活报告基因(图1Ⅱ)。

图1 哺乳动物双杂交分析原理。 “O”和“A”分别指DNA结合功能域和转录激活功能域。大多数转录因子是都包括一一个D和A (Ⅰ)。缺乏“A”可导致转录活性的丧失(Ⅱ)。 “D"和“A”可用通过分别融合到“D”和“A”上的两种有相互作用的蛋白质(X与Y1)而连接到一起(Ⅲ)。然而，与X并不发生相互作用但与A融合的蛋白，比如Y2,并不能恢复D-X融合蛋白的转录活性(Ⅳ)。

在双杂交分析里，这种连接就是一种蛋白质间的相互作用(即图1Ⅲ中的X和Y1)，它们二者分别融合到TAD和DBD而各自独立表达。在哺乳动物双杂交分析里，通常使用酵母转录因子Gal4的DBD和一个位于病毒强激活子VP16羧基端的78个氨基酸内的酸性TAD。比起酵母双杂交分析，哺乳动物双杂交分析的一个主要优点是可用于研究哺乳动物细胞系内的蛋白质间的相互作用。因此，这就使得我们可用其研究那些酵母没有被正确折叠的以及酵母内通常不存在的、需要翻译后修饰( 即磷酸化)或外来刺激诱导表达的蛋白质间的相互作用。

材料

材料
1.大肠杆菌感受态细胞(DH5a或其他适合的菌株; Invitroge cat. no. 18265017)。 2.碱性磷酸酶，小牛小肠(CIAP; NEW England Biolac cat. no. M0290)
3.限制性内切酶和T4 DNA连接酶(New England Biolabs)。 4.连接缓冲液(1 X ): 50mmol/L Tris+ HCL，pH 7.5,10mmol/L MgCl2, 10mmol/L二硫苏糖醇，1mmol/L ATP,25mg/ml牛血清白蛋白。
5.琼脂糖凝胶装置。 6. Luria-Bertani (LB) 培养基(含以及不含氨苄青霉素)及琼脂平板(含氨苄青霉素) (50ug/ml; LB肉汤培养基，Invitrogen, cat. no.12780029)。
7. pCMX - Gal4- N Gal4 DBD融合克隆载体也可用pM载体，购自Clontech, cat. no. K1618-1)。 8.pCMX-VP16-NVP16TAD融合克隆载体或pVP16载体，Clontech, cat. no. K1618- 1)。
9. pFR - Luc报告质粒(Stratagene, cat. no. 219050)。 10. pCMX - Ga14- VP16阳性对照载体。
11. pCMX- Gal4- ASC- 2阳性对照载体。 12. pCMX- VP16- RAR阳性对照载体。
13.适合用于哺乳动物细胞培养的培养基。例如，DMEM(Invitrogen,cat. no. 11995065)。 14.胎牛血清(FBS) (Invitrogen, cat. no. 10082139)。
15. D- PBS (Dulbecco磷酸盐缓冲液) ( Invitrogen, cat.no.14080055)。 16.1X胰酶EDTA (Invitrogen, cat. no. 25200056)。
17.全反式维甲酸(0.1 ~ 1μmol/L; Sigma Aldrich, cat. no.R2625)。 18. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, cat. no. 11668 - 019)或其他合适的转染试剂，若采用前者还必配备Opti-MEMI(Invitrogen, cat. no. 31985)。
19.哺乳动物细胞(如HeLa, CHO, CV-1, COS, 293 以及NIH3T3)。 20.荧光素酶分析试剂盒(细胞裂解液; Promega, cat. no.E 1531以及荧光素酶分析缓冲液; Promega, cat. no. E 1483)。
21.细胞培养板(24 孔; Costar, # 3524)。 22.荧光光度计(MicroLumat Plus LB 96V, Berthold Technolo-gies)。

方法

下面按三个方面描述方法:①构建嵌合表达质粒，②转染质粒到细胞，③测量荧光素酶活性。

3.1表达质粒

以下描述如何构建编码两个融合蛋白的质粒。这包括Gal4DBD-融合载体pCMX一GA14-N以及VP16TAD-融合载体pCMX- VP16-N (由Ron Evans博士提供)。通过限制性内切酶消化或PCR扩增，编码诱饵蛋白的DNA被插人到pCMX - Ga14-N,而编码靶蛋白的DNA被插人到pCMX- Vp16- N。编码诱饵或靶蛋白的DNA必须在相同的读码框分别表达为Gal4DBD和VP16 TAD。尤其是，通过使用一个PCR引物，在目的基因的末端要引入一个合适的限制性位点，这便可以在期望的地方和读码框掺人一个预设的限制性内切酶位点。对于那些有多克隆位点(multiple cloning site, MCS)的载体，它们可提供9个独特的位点而方便地进行克隆实验(图2A、2B)。