酿酒酵母基因编辑技术研究进展

作者：杨超月

为实现生物能源、精细化学品和天然产物等的绿色、可持续制造，利用代谢工程与合成生物学方法构建细胞工厂是一种有前途的策略[]。作为一种典型的真核生物系统，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae具有优良的鲁棒性、对苛刻发酵条件的耐受性、基因工程操作的高效性和公认的安全性(Generally recognized as safe，GRAS)，在学术研究和工业发酵中已经得到了广泛应用[-]。早期酿酒酵母主要用于发酵面制品(如面包、馒头、包子) 和酒精饮料(如啤酒、米酒) 等的生产，这一特性被很快用于燃料乙醇和单细胞蛋白的发酵生产。随着代谢工程技术的发展，酿酒酵母被越来越多的用于生产有机酸、氨基酸、核苷酸、药用蛋白、工业酶制剂和多不饱和脂肪酸(PUFAs)[]等，这些产品被广泛应用于食品、医药、饲料和化工行业[]。此外，酿酒酵母在天然产物的微生物异源合成方面也显示出了独特的优势。与原核生物相比，酿酒酵母具有较为完整的翻译后修饰系统和细胞器系统(例如线粒体、过氧化物酶体、内质网、高尔基体和液泡)，为天然产物的生物合成提供了不同的环境和间隔[-]，特别是在异源表达复杂代谢途径以及表达膜结合蛋白细胞色素P450氧化酶时表现出优越的能力[-]。目前，多种植物次生代谢产物已经在酿酒酵母中实现合成，如生物碱[]、芳香氨基酸[]、萜类[]和黄酮类[]等。最成功的例子是抗疟药物青蒿素前体物青蒿酸在酿酒酵母中的合成，产量高达25 g/L，并已实现工业化生产[]。

“设计-构建-测试-学习”是代谢工程的一般过程和实现细胞工厂构建预期目标的必经之路[] ()。其中，构建是验证设计的必要手段。然而，随着越来越多的化合物在酿酒酵母中实现合成，细胞工厂的构建与途径优化过程也暴露出了缺陷和局限，例如需要在单一位点进行多次操作[]，这已成为代谢工程的限速步骤。因此，开发高效的基因编辑工具势在必行。基因编辑技术是对目标基因组位点进行特异性修饰，包括基因敲除、敲入、替换和有义的点突变[]。基因编辑技术在现代生物技术中起到至关重要的作用，其要求对基因和基因组预定位置进行精确高效的编辑和修饰[-]。传统的基因编辑技术是根据DNA同源重组(Homologous recombination，HR) 原理，利用外源供体基因片段敲除或敲入目标基因片段，但这种方法效率较低，发生基因重组的概率在10-9-10-6[]。酿酒酵母中常用的基因编辑系统是Cre/LoxP系统，同样是基于同源重组原理的基因编辑技术[]。为了提高基因重组的效率，基因组双链断裂已经被证明有助于提高同源重组发生的概率[-]。基于此，新型基因编辑技术已经被开发利用，主要包括4种：归巢核酸内切酶(Meganucleases，MegNs) 系统、锌指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFNs) 系统、转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases，TALENs) 系统和CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 相关的系统()[]。这些新技术的开发和应用，极大地促进了代谢工程与合成生物学的发展。本文对酿酒酵母基因编辑技术的发展和现状进行了总结，包括早期基因编辑技术、新型编辑技术和高通量编辑技术等。并对酿酒酵母基因编辑技术的发展前景进行了展望。

酿酒酵母基因编辑技术研究进展

图 1 酿酒酵母细胞工厂构建 Fig. 1 Construction of S. cerevisiae cell factory.

表 1 基因编辑技术在酿酒酵母中的应用 Table 1 Application of gene editing technology in S. cerevisiae

Technology Principle Advantages Disadvantages References
HDR Homologous end joining Easy to implement Needs marker []
5-FOA/URA3 Toxicity of 5-FOA to URA3 gene Recyclable marker Long experiment period []
Cre/LoxP Cre-mediated site-specific recombination High efficiency,
recyclable marker Needs marker removal, loxP
site left on genome []
FLP/FRT FLP-mediated site-specific recombination High efficiency,
recyclable marker Needs marker removal, FRT
site left on genome []
Meganuclease Meganuclease mediated double
strand break High specificity DNA recognition site engineering difficulty []
ZFNs ZFNs-mediated site-specific recombination High specificity, programmable Requiring substantial protein engineering, diseconomy [-]
TALENs TALE nuclease mediated double strand break High specificity, programmable Requiring complex molecular cloning methods, diseconomy [-]
CRISPR/Cas RNA guided nuclease mediated double strand break High efficiency, economy, multiplex genome editing Possible off-target [, ]

1 酿酒酵母经典基因编辑技术