同样做双荧光检测，为什么结果跟师兄差这么多

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

同样做双荧光检测，为什么结果跟师兄差这么多？

2021-11-09 18:27 来源: 戴老师的体育课堂

原标题：同样做双荧光检测，为什么结果跟师兄差这么多？

最近一直在做双荧光素酶报告基因检测，都已经一个多月了，荧光值偏低、转染效率低、复孔重复性差……明明和师兄做的步骤一模一样，为什么结果却相差这么多？屁颠屁颠跑去问师兄，谁知他直接给了我一套实验方案和常见问题分析答疑，受宠若惊，以后再也不用担心实验的问题啦。

你在做双荧光素酶报告基因检测实验中还遇到过什么问题？留言回复 点赞前五名的同学可 获得激光翻页笔一支。

荧光素酶（Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最具代表性的是萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase）。荧光素酶可以催化 luciferin 氧化成 oxyluciferin，在 luciferin 氧化过程中，会发出生物荧光，可通过荧光测定仪测定 luciferin 氧化过程中释放的生物荧光。

双荧光素酶报告基因检测实验包括两种荧光素酶，即萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶 [1] 。 这两种荧光素酶作用方式不同。一是底物和辅助因子不同，萤火虫荧光素酶需要荧光素、O 2 、ATP 和 Mg 2+ ，而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和 O 2 。二是发光颜色不同，萤火虫荧光素酶产生黄绿色光，发光波长为 560 nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，发光波长为 465 nm。

图 1. 两种荧光素酶检测原理

实验方案

借助双荧光素酶报告基因检测实验对启动子结构进行分析验证，可先对启动子基本序列进行验证，再对其核心区域进行验证，实验主要流程如下。

验证启动子序列

1、分析启动子

根据已有信息并利用各种生物信息学在线软件，初步确定目的基因启动子可能所在位置。

2、构建载体

将预测序列构建到带有报告基因的质粒上，构建表达载体。载体通常使用 pGL4.20 载体和 pRL 系列载体。

3、转染表达

将所要检测的质粒和带有海肾荧光素酶基因的质粒转染进入细胞内，扩增表达荧光素酶。

4、裂解检测

加入细胞裂解缓冲液，添加发光底物，用荧光检测仪或酶标仪进行检测。

5、统计分析

借助 GraphPad Prism5 等软件进行绘图，并分析实验结果。

验证启动子核心区域

为寻找目的基因启动子核心区域，首先分析目的基因启动子区域的构成，将目的基因启动子重要结构域进行缺失构建，接着将构建载体进行转染表达，裂解检测，最后对获得数据进行统计分析，以此寻找验证启动子核心区域。

图 2. 实验基本技术路线

常见问题及解决方案（DL101）

Q1 荧光值低

可能原因及解决方案如下：

可能原因

解决方案

转染效率与表达效率低

多做预实验优化转染条件；在质粒上加 GFP 作为转染效率验证。

操作不当

使用排枪，加完立刻上机检测；提前设置好机器检测程序。

试剂存放不当

Luc 按要求分装好存放于 -80℃，Renlia 底物存放于 -20℃，且 Renlia 预先溶解于乙醇中，需注意乙醇挥发问题。

反应体系不适

细胞裂解液：底物 = 1 : 5，若减少底物用量，需要对应减少细胞裂解液用量以平衡反应体系。

Q2 复孔重复性差

可能原因及解决方案如下：

（1）实验平行复孔（不同细胞孔）：不同孔之间的数值影响因素较多。建议做同一个细胞孔裂解液的技术性平行来检测试剂重复性。

（2）来源于同一个细胞孔的裂解液复孔：注意实验操作、加样顺序、加样速度及加样量。检查排枪加样是否存在不均一问题。

（3）控制不同样品和底物混合后至上机检测的时间间隔尽量一致。