【科技前沿】专家点评：徐彦辉/陈飞合作发现新
编者按
毋庸置疑，基因转录的精细调控是细胞生命活动的核心，然而围绕RNA聚合酶Pol II的C端结构域CTD的磷酸化是如何被精细调控的很长一段时间都是领域内的关键科学问题，过去更多的是比较清楚CTD如何被加上磷酸化开启转录调控，但是CTD的磷酸化如何精细的被去除从而抑制转录的相关研究相对缺乏。今日在线的Science论文首次发现PP2A这一最重要的磷酸酶可与Integrator复合物形成一个全新的转录调控复合物 INTAC直接调控转录，拓展了转录调控和PP2A相关领域的研究边界。有鉴于此，BioArt特别邀请到了长期从事磷酸酶相关研究的冯新华教授和长期从事转录调控研究的朱冰教授点评，以飨读者！
点评 | 冯新华（浙江大学生命科学研究院）
朱冰（中科院生物物理所）
基因表达的精密调控，对生命体的形成、发育以及各种生物学功能的维持至关重要；基因表达的紊乱，与各种疾病的发生息息相关。转录是基因表达的最核心步骤。真核生物的转录过程主要分为转录起始（initiation）、暂停（pausing）、延伸（elongation）和终止（termination）四个步骤。RNA聚合酶II （Pol II）在转录进程中，受到转录因子和Pol II本身的翻译后修饰调节。哺乳生物中Pol II的C端结构域（C-Terminal Domain，CTD）由52个七肽重复序列组成，它的不同位点的磷酸化和去磷酸化的动态调控与Pol II的转录进程紧密相连【1,2】。比如，CDK7催化的CTD第五位丝氨酸（pSer5）的磷酸化调控了转录暂停，而CDK9和CDK12/13共同调控的CTD第二位丝氨酸的磷酸化（pSer2）调控了转录延伸和终止【3】。相对于对调节CTD磷酸化的激酶的广泛研究，人们对CTD动态调控中的去磷酸化却知之甚少。转录过程复杂性的另一方面体现在RNA产物的剪切过程，代表性分子如Integrator复合物能够剪切暂停状态下Pol II所合成的RNA促进转录终止【4】。但Integrator剪切功能如何发生仍不清楚。尤其是RNA剪切与Pol II磷酸化调控的相互关联性，极少有报道。
2020年11月27日，复旦大学徐彦辉课题组和陈飞课题组合作在Science杂志在线发表题为Identification of Integrator-PP2A complex (INTAC), an RNA Polymerase II phosphatase 的研究长文（Research Article）。该项研究发现了一个全新的转录调控复合物 INTAC（16个亚基，分子量近1.5MDa），解析了INTAC的高分辨冷冻电镜结构，揭示了INTAC作为一个双功能酶，同时具备RNA剪切和去磷酸化活性，可去除Pol II的多个CTD磷酸化位点发挥转录抑制功能。该项研究首次发现PP2A这一最重要的磷酸酶可直接调控转录，拓展了这两个重要研究领域的研究范畴。
PP2A是人体中最重要的蛋白质磷酸酶之一，在某些组织中其含量甚至达到总蛋白量的1%。在细胞内调控多种生命过程并参与多种疾病的发生，但以往没有PP2A直接参与转录调控的报道。研究团队解析了INTAC的高分辨结构（整体分辨率3.5 Å），发现核酸酶（Endonuclease）和磷酸酶（Phosphatase）这两个催化模块分布在核心的骨架模块两侧。进一步的生化研究发现，INTAC中的PP2A-AC去除Pol II CTD磷酸化并抑制转录活性。其中Integrator作为非经典的调控亚基，招募Pol II，使PP2A-AC发挥去磷酸化活性。INTAC的磷酸酶与核酸酶的活性分别调控转录的不同过程，即核酸酶活性主要调控基因的启动子近端终止，而去磷酸化酶活性则能够同时抑制暂停Pol II的释放和转录延伸。
该项工作明确了PP2A直接调控基因转录，不仅拓展了转录调控和PP2A相关领域的研究边界，也对靶向PP2A的药物开发提出了重要的指导。以往的PP2A靶向药物开发都只关注其调控信号通路的作用，后续的开发就需要考虑其直接调控转录的功能。
值得一提的是，徐彦辉教授早年在博后期间（导师为施一公教授）最主要的工作就是围绕蛋白质磷酸酶PP2A的结构与工作做了大量重要的工作，阐明了PP2A发挥功能的结构基础及其在肿瘤发生中的作用机理【5-8】（Cell，2006a，2006b；NSMB，2007；Mol Cell，2008），没想到14年后，徐彦辉教授团队在解析负责RNA产物剪切的Integrator复合物的重要研究中再次邂逅了PP2A，正所谓朱冰老师在点评中提到提到的“兜兜转转，人生何处不相逢”。本次Science论文的另一位通讯作者陈飞研究员是徐彦辉课题组早年毕业的硕士，之后在在美国西北大学医学院Ali Shilatifard实验室完成表观遗传学和基因表达方向的博士训练，还在Memorial Sloan Kettering Cancer Center的Joan Massague（TGF-β信号转导与肿瘤转移研究领域的执牛耳者 ）实验室完成肿瘤转移和信号转导方面的博士后训练，在Cell、Science、Mol Cel、Gene & Dev上以第一作者发表过多篇研究论文，在上述背景之下，徐彦辉组和陈飞组的合作配合是非常契合的。总的来说，这篇Science最值得称道的地方还在于前文提到的“首次明确了PP2A直接调控基因转录，拓展了转录调控和PP2A相关领域的研究边界，还对靶向PP2A的药物开发提出了重要的指导”，这是一篇结构解析与生物学功能研究结合完美的典范之作，该工作也是徐彦辉课题组继年初在Science上发表研究长文揭示人源BAF复合物的染色质重塑机制（详见BioArt报道：）之后，在转录调控相关结构功能研究中收获的又一次重量级成果。
据悉，复旦大学附属肿瘤医院博士后郑海、复旦大学生物医学研究院2017级博士生戚轶伦、助理研究员胡士斌、博士后徐从玲、中科院上海营养与健康研究院博士后曹璇为本文共同第一作者，徐彦辉和陈飞为共同通讯作者。
原文链接：
https://science.sciencemag.org/content/370/6520/eabb5872
专家点评
冯新华（浙江大学生命科学研究院教授、浙江大学求是讲席教授）
RNA Pol II的C端结构域（carboxy-terminaldomain，CTD）具有调控转录和RNA加工的重要功能。人类Pol II的CTD包含了52个Y1S2P3T4S5P6S7重复序列，不同程度的翻译后修饰组合定量地决定着特定基因转录的起始、延伸和终止。细胞以何种机制在时空上精准地调控CTD磷酸化状态是长久以来的一个重要科学问题。目前已知的CTD激酶包括CDK7、CDK9、CDK12、CDK13、GSK3b、ERK1/2和DYRK1A等；其中CDK7（TFIIH亚基）负责催化第五位丝氨酸磷酸化(P-Ser5)，CDK9（P-TEFb亚基）负责催化第二位丝氨酸磷酸化(P-Ser2)。此外，磷酸酶FCP1、SCP1、RPAP2和SSU72等负责擦除CTD上的磷酸化修饰。这些激酶和磷酸酶协同作用，共同谱写了基因转录过程中的“CTD磷酸化交响曲”。UC Berkeley周强实验室的工作表明，CTD磷酸化状态通过相分离形成转录的功能区室，这些具有不同功能的相变区室共同组成了“CTD磷酸化交响曲”的各个乐章(Lu et al. 2018)（）。因此，阐明CTD发生动态修饰的分子机制可以帮助我们更好地理解各个乐章之间的相互转换。
Integrator多亚基复合物在多细胞生物中具有高度保守性，包含至少14个INTS亚基。2005年的一项研究发现，Integrator能够与Pol II CTD结合，并通过其RNA核酸内切酶活性介导了核内小RNA（small nuclear RNAs，snRNAs）3’端的加工。随后的研究发现Integrator还能参与转录阻滞释放、转录延伸、增强子RNA（eRNA）转录等过程，提示Integrator具有不依赖核酸内切酶活性的转录调控功能。但是，受限于它的组成复杂，样品的不易获得，近年来关于Integrator复合物的机制研究相对滞后。犹如盲人摸象，我们目前只了解Integrator一些独立组分的结构，但对于整个复合物的全貌我们还知之甚少。最近，徐彦辉实验室(Zheng et al. 2020)和Wagner实验室(Huang et al. 2020)分别发现Integrator复合物具有招募磷酸酶PP2A，从而结合Pol II CTD并去除其Ser2/5/7磷酸化的功能。
徐彦辉课题组和陈飞课题组合作的最新Science文章（“Identification and of Integrator-PP2A complex（INTAC）, an RNA Polymerase II phosphatase”），从结构生物学和生物化学的角度，给整个Integrator复合物的结构和功能绘制了一个全貌信息：Integrator能够与蛋白质磷酸酶PP2A形成复合物INTAC，除了发挥已知的RNA核酸内切酶的功能外，还在转录过程中完成对CTD的去磷酸化，从而影响转录的不同阶段。INTAC复合物的冷冻电镜结构（分辨率3.5Å）显示，它包含PP2A的A亚基和C亚基，没有传统的PP2A全酶的调控亚基B（或者B’、B’’、B’’’）。因此，Integrator复合体充当了PP2A的调节亚基角色，其中INTS5，INTS6，INTS8亚基直接结合在PP2A-AC核心酶上，组装成为INTAC复合物中的磷酸化酶模块。而Wagner的生化实验认为INTS8招募PP2A到RNA Pol II，但是缺乏关键的体外重组蛋白实验展示INTS8-PP2A相互作用，更缺乏结构生物学数据的支持INTS8究竟是独立地还是以Integrator复合体的形式发挥作用。徐彦辉团队的工作更为全面和精确，他们的发现提供了INTAC复合物的高分辨率结构，全面地展示了Integrator复合体与PP2A核心酶相互作用并装配为非经典PP2A全酶。生化和细胞水平实验进一步揭示了INTAC中PP2A介导Pol II CTD去磷酸化并调控基因转录的机制。这项研究不仅提示了PP2A生物学功能的广谱性，也为后续研究磷酸酶和RNA核酸内切酶在转录过程中独立及协同作用的调控机制起到了很好的范式作用。
最后，这项研究也带来了新的思考，PP2A是否还存在新型的调节亚基（如其它复合物、RNA等）？INTAC是否还有CTD相联系或其它的底物？INTAC活性在不同的细胞类型、不同的细胞状态（如细胞周期）以及不同的器官发育阶段如何调控？不同的CTD磷酸酶如何在时空上协调它们的作用？在不同的物种里和进化长河中这些CTD磷酸酶如何获得现在的角色？这些问题尚有待进一步探讨。
References：
Lu H et al. 2018. Phase-separation mechanism forC-terminal hyperphosphorylation of RNA polymerase II. Nature,558(7709):318-323.
Zheng et al. 2020. Identification of integrator-PP2Acomplex (INTAC), an RNA polymerase II phosphatase. Science, 370(6520),esbb5872.
Huang et al. 2020. Integrator recruits proteinphosphatase 2A to prevent pause release and facilitate transcriptiontermination. Molecular Cell, 80(2):175-376
朱冰（中科院生物物理所研究员）
兜兜转转，人生何处不相逢
RNA聚合酶II最大的亚基有一个奇特的C端结构域 (CTD)，一个七肽序列YSPTSPS在人源的CTD中重复多达52次，其中富含可供磷酸化的氨基酸残基。该序列中第5位和第2位丝氨酸残基上的磷酸化修饰相对最耳熟能详，因为前者是转录起始阶段RNA聚合酶II的特征，而后者则是转录延伸阶段RNA聚合酶II的特征。
徐彦辉组的这一工作非常有意思，他们纯化鉴定了INTAC复合体并解析了其结构和组装机制。INTAC复合体含有两个部分：参与转录调控的Integrator复合体和去磷酸化酶PP2A复合体的核心酶（PP2A-A和PP2A-C）。Integrator复合体最初是2005年由我师兄Ramin Shiekhattar课题组纯化鉴定的，当时他们用CTD和细胞核抽提物进行亲和纯化，得到了Integrator复合体。Integrator和CTD结合紧密，又和去磷酸化酶PP2A结合紧密，再加上CTD高度磷酸化，这显然将INTAC复合体的去磷酸化酶活性的底物指向了CTD。果然，徐彦辉组证明INTAC在体外和体内都能导致CTD的去磷酸化，并进一步分析了其对转录调节的功能。当然，INTAC究竟主要在转录的什么阶段利用其去磷酸化酶活性来调控转录将会是今后值得深入研究的方向。
这是一个工作量很大的工作，按理很可能可以作为两篇Science来发表（BioArt注：经求证，事实上一开始是按照两篇论文同时投稿最后合并为一篇15页的研究长文 ），一篇聚焦INTAC复合体的纯化鉴定和功能分析，一篇聚焦INTAC复合体的结构（毕竟Integrator复合体的结构也尚未得到解析）。两个工作最终合二为一，说明一来科学家们能做的事情越来越多，二来科学家们必须做的事情也越来越多。这也许就是Whatever possible has to be done吧。
最后，这一工作的花絮是徐彦辉教授在博士后期间的主要研究成果就是PP2A全酶复合体的结构，他独立以后在表观遗传修饰和转录调控相关的结构生物学研究方面做了大量出色的工作。而这次是从转录又回头遇见了PP2A，真所谓“兜兜转转，人生何处不相逢”。
参考文献
1. F. X. Chen, E. R. Smith, A. Shilatifard, Born to run: control of transcription elongation by RNA polymerase II. Nat Rev Mol Cell Biol 19, 464-478 (2018).
2. I. Jonkers, J. T. Lis, Getting up to speed with transcription elongation by RNA polymerase II. Nat Rev Mol Cell Biol 16, 167-177 (2015).
3. D. E. Lyons, S. McMahon, M. Ott, A combinatorial view of old and new RNA polymerase II modifications. Transcription 11, 66-82 (2020).
4. M. S. Mendoza-Figueroa, D. C. Tatomer, J. E. Wilusz, The Integrator Complex in Transcription and Development. Trends in biochemical sciences, (2020).
5. Xu, Y. #, Xing, Y. #, Chen, Y. #, Chao, Y. #, Lin, Z., Fan, E., Yu, J.W., Strack, S., Jeffrey, P.D. and Shi, Y. (2006) Structure of the protein phosphatase 2A holoenzyme. Cell 127, 1239-1251.
6. Xing, Y. #, Xu, Y. #, Chen, Y. #, Jeffrey, P.D., Chao, Y., Lin, Z., Li, Z., Strack, S., Stock, J.B. and Shi, Y. (2006) Structure of protein phosphatase 2A core enzyme bound to tumor-inducing toxins. Cell 127, 341-353.
7. Chen, Y. #, Xu, Y. #, Bao, Q., Xing, Y., Li, Z., Lin, Z., Stock, J.B., Jeffrey, P.D. and Shi, Y. (2007) Structural and biochemical insights into the regulation of protein phosphatase 2A by small t antigen of SV40. Nature structural & molecular biology 14, 527-534.
8. Xu, Y. #, Chen, Y. #, Zhang, P., Jeffrey, P.D. and Shi, Y. (2008) Structure of a protein phosphatase 2A holoenzyme: insights into B55-mediated Tau dephosphorylation. Molecular Cell 31, 873-885.
本文转载自公众号“BioArt”（BioGossip）
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