Cell 重磅：新一代荧光探针实现活体动物深层神经

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

　　大脑是如何思考的？这是神经科学家长期求索的终极问题之一。思考的秘密藏在瞬息万变的神经电信号和复杂精妙的神经网络中，而长期精确地记录神经系统的复杂活动目前仍然受到技术和工具的限制。

　　为了解决这一问题，2022年8月18日，美国德州休斯顿的贝勒医学院（Baylor College of Medicine）的François St-Pierre研究组联合德国图宾根大学（University of Tübingen）的Katrin Franke研究组，美国斯坦福大学（Stanford University）的 Thomas R. Clandinin研究组，贝勒医学院的 Andreas Tolias和Jacob Reimer研究组，以及法国巴黎高等师范学校（École normale supérieure）的Stéphane Dieudonné研究组在Cell发表题为Sustained deep-tissue voltage recording using a fast indicator optimized for two-photon microscopy的文章。文章报道了一种新型的基因编码膜电位荧光探针，它兼容双光子荧光显微技术，能实现对深层神经活动的长时间检测，帮助读取毫秒级别的神经元电信号。该探针首次实现了在清醒、活动的模式生物中的长期神经成像，为实现神经科学的终极梦想提供了更多可能。

　　荧光反馈电信号

　　我们的所思所想一举一动都由大脑来支配。其中近千亿神经元组成复杂的回路，每时每刻都在用电信号来传递信息。要了解大脑运算的机理，诸如突触可塑性、学习和行为的关系，脑科学家急需能长期稳定检测神经信号的方法。早期对神经信号的检测主要依赖于电极记录。这种方法通过将实体电极植入神经周围的组织，能读取快速的神经信号。然而，电极探测不仅很难限制采样神经的种类，而且也难免对脑组织造成损伤。

　　科学家随后发现，利用荧光变化来表征神经信号的基因编码探针，能避免电极法的诸多弊端。最先得到广泛应用的是基因编码钙离子探针（GECI）。这种蛋白能通过荧光的强弱来反应细胞内钙离子浓度的变化。然而，因为钙离子反应缓慢，并且并不完全和膜电位关联，钙离子探针无法直接反馈快速的单个动作电位，也不能报告不激起钙离子变化的阈下电活动。钙离子探针因此尚不能完全比拟电极观测的解析度。

　　这篇文章则针对基因编码膜电位探针（又称基因编码电压指示器，GEVI），一种能将神经膜电位直接转换为荧光信号的跨膜蛋白。膜电位探针理论上可用于弥补钙离子探针的不足，然而在实际操作中，初代膜电位探针在亮度，灵敏度，速度和光稳定度上的欠缺。极大地限制了在活体动物行为实验中的应用。为了填补这一技术差距，St-Pierre团队通过在生物、硬件和软件上的创新，优化了膜电位探针以扩大它在神经科学领域的应用。

　　双光子优化

　　由于很少有原生的荧光蛋白能够感应膜电位的变化，初代膜电位探针大多是理性蛋白设计的产物：科学家组合并修改多种蛋白的氨基酸序列，然后通过电生理膜片钳技术（patch clamp）逐一测试它们的电压感受性。然而，通过序列对蛋白质特性的预测难度大，电生理实验的过程也漫长而枯燥。该研究组认为，要取得膜电位探针性能的突破，就必须从根本上改进优化方法，从而打破实验的瓶颈，缩短蛋白优化的周期。

　　来自莱斯大学（Rice University）的博士生，共同第一作者刘卓和因此设计了一套用来优化膜电位探针的高通量筛选平台。该平台能快速地对蛋白变体库进行测试和分析，从几千个候选变体中找出表现最优的蛋白。此平台利用一对铂金电极，对放置于96孔板上的表达膜电位探针变体的HEK293细胞进行电场刺激。从这刺激激起的荧光反应上，膜电位探针的亮度、灵敏度、速度和光稳定度能被同时评价，以便辨别出在各项属性中胜出的新型膜电位探针。

　　这个筛选平台不仅在通量上和评价属性的种类和数量上有革新，还是首个利用双光子荧光显微技术进行膜电位探针筛选的平台。双光子显微是脑科学界热门的成像方法，它通过两个长波长的光子来激发荧光蛋白。比起传统荧光显微，双光子显微具有更小的光毒性，能穿透到更深层的组织，并且避免焦平面外的激发，从而提供更高质量的信号。研究组发现膜电位探针在单光子激发和双光子激发下的表现可能存在很大差异，所以如果在筛选时就尽早使用双光子来评价膜电位探针，就能确保高通量性能的评估更贴近实际应用时的表现。

　　共同第一作者博士生陆晓雨（莱斯大学）和勾越阳（贝勒医学院）以及其他组员，随后将此平台应用于对ASAP系列膜电位探针的定向进化。他们将21个单残基突变分别引入到ASAP序列中，最终在所产生的变体库中找到了表现优异的一种膜电位探针。随后，陆晓雨使用膜片钳等技术对这个新探针进行了体外量化分析，她发现这种新型探针的反应的确又快又灵敏，在亮度和光稳定度上也有很大的提高。这种新型基因编码膜电位探针被命名为JEDI-2P，其中2P照应它杰出的双光子性能。

　　新膜电位探针大显身手

　　这篇文章的另一亮点是将JEDI-2P与多项显微技术结合，把光学电生理应用到多种模式生物上。首先，来自德国图宾根大学的Katrin Franke教授和她的研究组将JEDI-2P用于观测体外分离的小鼠视网膜上SAC细胞对光刺激的表现。然后，来自斯坦福大学的Thomas Clandinin教授和他的团队用JEDI-2P来研究果蝇中间神经元对光刺激信号的传导。这两个研究组证实了，相比过往的膜电位探针，反应迅速的JEDI-2P能将高频短暂的神经信号准确地转换为荧光信号。

　　随后，同样来自贝勒医学院的Andreas Tolias教授和Jacob Reimer教授挑战了用传统点扫描（resonant scanning）双光子显微成像来捕捉在小鼠视觉皮层的神经电活动。虽然受限于传统点扫描的低采样率，JEDI-2P的荧光信号仍能清晰地追踪的单个动作电位，经过尖峰推测算法的分析，能达到比经典钙离子观测更高的和电极记录的相关性。

　　最后，来自法国巴黎高等师范学校的Stéphane Dieudonné教授和他的团队，包括共同第一作者Vincent Villette，将JEDI-2P引入双光子随机访问显微技术ULoVE来探究位于小鼠视觉皮层深处的神经元活动。ULoVE能对深达400多微米的单个神经元以惊人的5 kHz的速度采样，甚至能对一对神经元进行亚毫秒的观测。此技术将新膜电位探针的优势展现得淋漓尽致，在长达40多分钟的观测中，JEDI-2P优异的响应度和持久度能清晰捕捉单个动作电位。这样长时间在活体内的高质量光学电记录前所未有。JEDI-2P可谓是一个振奋人心的开端。我们可以预见，在未来广域快速的脑神经观测上，可以更多地看到新一代基因编码膜电位探针的身影。

　　期待和寄语

　　“2014年，当我在神经科学学会上展示初代膜电位探针时，人们对我翻白眼，认为用荧光蛋白来捕捉快速的神经信号是天方夜谭，更别说对活体清醒动物进行毫秒级的探测”，St-Pierre教授说，“而8年后，我们做到了！但这并不会是膜电位探针优化路的尽头（“This will not be the last JEDI!”），还有很多进步的空间。”

　　“6年前，当我开始这个课题的时候，人们对基因编码膜电位探针的认知很少，以至于我亲自动笔编写了维基百科基因编码膜电位探针（GEVI）的词条。如今，我希望这新一代膜电位探针，配合新型显微技术，能给业界带来更多对光学电观测的信心。”刘卓和说，“这是我们团队所有课题组一同努力的结果，这样的合作让我欣慰。”

　　“我们还在继续优化JEDI，有志于加入我们探针开发团队的或者有勇气尝试我们新开发的GEVI的脑科学家们，不要犹豫和我们联系”，陆晓雨说。

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　　原文链接：

　　https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(22)00916-3