经验分享：琼脂糖凝胶电泳检测DNA方法简介

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷在电场中向正极移动。由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。

DNA分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。

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主要试剂

1. 10 x TAE (10倍体积的TAE储存液)

配 1000mL50 x TAE：

Tris 242g

冰乙酸 57.1ml

0.5 mol/L EDTA 100 ml

pH 8.0

2. 凝胶加样缓冲液（6x）

溴酚蓝 0.25％

蔗糖 40％

3. 琼脂糖（1%）：称1g琼脂糖，放入250 mL三角瓶内，加入100 mL 1×TAE电泳缓冲液，加热煮沸等其冷至60℃左右，倒入封好的电泳板上。

4. 溴化乙锭溶液 (EB) 0.5 μg /mL。

主要设备

电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪、移液枪一套、微波炉。

实验步骤

（一）制备琼脂糖凝胶

称取0.1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入10mL 1XTAE缓冲液，至微波炉加热至完全溶化，取出摇匀，则为1％的琼脂糖凝胶液。

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（二）胶板的制备1. 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好。

2. 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。

3. 将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

4. 待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。

5. 加入电泳缓冲液至电泳槽中。

（三）加样

将样品5uL与上样缓冲液1uL混合，用移液枪将该混合样品加入样品孔（记录点样顺序及点样量）。同时加入DNA marker和购买的pUC18质粒

作为对照。

（四）电泳

1. 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5 V/cm。

2. 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳。

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（五）染色

将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液（0.5mg/mL）中，染色以观察在琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作）。

（六）观察

琼脂糖凝胶电泳优点

琼脂糖凝胶是具有大量微小孔道的基质，其孔径尺寸取决于它的浓度。0.075琼脂糖的孔径为800nm,0.16的孔径为500nm，1%的琼脂糖孔径为150nm，这都是常用的琼脂糖凝胶的浓度，可以分离0.1-60kb左右的DNA，大孔性有利于免疫固定、免疫电泳和微量制备；

琼脂糖具有较高机械强度，允许在1%或更低的浓度下使用；且与别的生物只存在微弱的结合；

琼脂糖无毒，琼脂糖胶凝固过程不会发生自由基聚合，无需催化剂；

琼脂糖胶具有热可逆性，低熔点易于回收样品，可用于对温度敏感材料的制备；

易于保存，是高灵敏放射自显影的理想材料。