一种荧光免疫层析标记物及其制作方法与流程

作者：杨超月

1.本发明涉及免疫分析技术领域，具体涉及一种荧光免疫层析标记物及其制作方法。

背景技术：

2.免疫分析技术，是利用抗原与抗体的特异性结合作用来检测目标物的一种技术，而其中最主要的技术就是免疫标记技术。免疫标记技术是将既容易测定又具有高敏感性的物质标记到特异性抗原或者抗体蛋白上，通过这些标记物的增强放大作用来显示反应体系中抗原或者抗体的性质和含量的技术。
3.目前免疫标记技术常用的荧光免疫层析标记物主要包括胶体金和乳胶等。但在实际应用中，这些荧光免疫层析标记物都存在不同缺陷。例如胶体金和乳胶标记物存在灵敏度低的缺点导致准确性不够，无法完全满足市场对免疫标记产品的需求；同时存在重复性不高的问题，且制作方法比较复杂。因此，目前市场对制作简单、高准确性、高重复性荧光免疫层析标记物有很大的需求。

技术实现要素：

4.本发明提供了一种荧光免疫层析标记物及其制作方法。本发明的荧光免疫层析标记物：偶氮苯磺酸镍配合物偶联hbp抗体，可以有效提高免疫标记技术中检测准确性与重复性，同时制作方式简单快捷，方便大规模适用。
5.为实现上述目的，本发明一种荧光免疫层析标记物及其制作方法，所述的制作方法为：
6.(1)将偶氮苯磺酸镍配合物用缓冲液混合,然后在2-8℃的条件下，以5000rpm的转速离心10-15min；
7.(2)将步骤(1)离心后的沉淀复溶，并通过超声分散均匀，然后以偶氮苯磺酸镍配合物与hbp抗体的质量比为50:1-10:1比例加入hbp抗体，振荡反应；
8.(3)反应结束后在步骤(2)的溶液中加入偶联剂进行偶联反应，之后在2-8℃的条件下，以5000rpm的转速离心10-15min去除上清液；
9.(4)将步骤(3)离心后的沉淀复溶，然后加入封闭剂进行封闭反应，之后在2-8℃的条件下，以5000rpm的转速离心10-15min去除上清液；
10.(5)将步骤(4)离心后的沉淀复溶，并通过超声分散均匀，获得荧光免疫层析标记物。
11.进一步的，所述hbp抗体源自鼠、兔和羊的一种或多种；常见抗体来源，抗体应用技术成熟，更方便应用于人体检测。
12.进一步的，所述缓冲液为pbs缓冲液、tris缓冲液和硼酸盐缓冲液的一种或多种；有效的防止外来因素对于整体稳定性的冲击。
13.进一步的，所述封闭剂为酪蛋白和bsa的一种或多种；配合偶氮苯磺酸镍配合物偶
联的hbp抗体增强重复性。
14.进一步的，所述偶联剂为戊二醛和碳化二亚胺的一种或多种；促进偶氮苯磺酸镍配合物与hbp抗体进行偶联。
15.本发明的荧光免疫层析标记物为上述任一的制作方法制备的偶氮苯磺酸镍配合物偶联的hbp抗体。
16.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
17.1)本发明所述制作方法操作简单，成本低廉，不需要昂贵的高精仪器进行辅助即可进行，降低了成本，适合大规模制备。
18.2)本发明的荧光免疫层析标记物，每个偶氮苯磺酸镍配合物偶联的hbp抗体中的偶氮苯磺酸镍配合物可包表成千上万个荧光分子，大大提高了荧光的标记效率，有效提高了分析灵敏度，增加准确性。
19.3)偶氮苯磺酸镍配合物与抗体的共价偶联，提高了检测的重复性。
具体实施方式
20.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合具体实施例进行详细描述。
21.对照组1：
22.市面常见的乳胶检测试纸条，使用方法按照其说明书进行。
23.对照组2：
24.市面常见的胶体金检测试纸条，使用方法按照其说明书进行。
25.实施例1：
26.本实施例的一种荧光免疫层析标记物制作方法为：
27.(1)将偶氮苯磺酸镍配合物用pbs缓冲液混合,然后在2℃的条件下，5000rpm离心10min；
28.(2)将步骤(1)离心后的沉淀复溶，并通过超声分散均匀，然后以偶氮苯磺酸镍配合物与hbp抗体的质量比为50:1比例加入hbp抗体，振荡反应；
29.(3)反应结束后在步骤(2)的溶液中加入戊二醛进行偶联反应，之后在2℃的条件下，5000rpm离心10min去除上清液；
30.(4)将步骤(3)离心后的沉淀复溶，然后加入酪蛋白进行封闭反应，之后在2℃的条件下，5000rpm离心10min去除上清液；
31.(5)将步骤(4)离心后的沉淀复溶，并通过超声分散均匀，获得荧光免疫层析标记物。
32.进一步的，所述hbp抗体源自兔。
33.本实施例的荧光免疫层析标记物为上述的制作方法制备的偶氮苯磺酸镍配合物偶联的hbp抗体。
34.检测方法：
35.将偶氮苯磺酸镍配合物偶联的hbp抗体结合在试纸条上，通过荧光定量分析检测。
36.实施例2：
37.本实施例的一种荧光免疫层析标记物制作方法为：
38.(1)将偶氮苯磺酸镍配合物用pbs缓冲液、tris缓冲液和硼酸盐缓冲液混合,然后在5℃的条件下，5000rpm离心13min；
39.(2)将步骤(1)离心后的沉淀复溶，并通过超声分散均匀，然后以偶氮苯磺酸镍配合物与hbp抗体的质量比为30:1比例加入hbp抗体，振荡反应；
40.(3)反应结束后在步骤(2)的溶液中加入戊二醛与碳化二亚胺进行偶联反应，之后在5℃的条件下，5000rpm离心13min去除上清液；
41.(4)将步骤(3)离心后的沉淀复溶，然后加入bsa与酪蛋白进行封闭反应，之后在5℃的条件下，5000rpm离心13min去除上清液；
42.(5)将步骤(4)离心后的沉淀复溶，并通过超声分散均匀，获得偶氮苯磺酸镍配合物偶联的hbp抗体。
43.进一步的，所述hbp抗体源自鼠、羊和兔。
44.本实施例的荧光免疫层析标记物为上述的制作方法制备的偶氮苯磺酸镍配合物偶联的hbp抗体。
45.检测方法：
46.将偶氮苯磺酸镍配合物偶联的hbp抗体结合在试纸条上，通过荧光定量分析检测。
47.实施例3：
48.本实施例的一种荧光免疫层析标记物制作方法为：
49.(1)将偶氮苯磺酸镍配合物用硼酸盐缓冲液混合,然后在8℃的条件下，5000rpm离心15min；
50.(2)将步骤(1)离心后的沉淀复溶，并通过超声分散均匀，然后以偶氮苯磺酸镍配合物与hbp抗体的质量比为10:1比例加入hbp抗体，振荡反应；
51.(3)反应结束后在步骤(2)的溶液中加入碳化二亚胺进行偶联反应，之后在8℃的条件下，5000rpm离心15min去除上清液；
52.(4)将步骤(3)离心后的沉淀复溶，然后加入bsa进行封闭反应，之后在8℃的条件下，5000rpm离心15min去除上清液；
53.(5)将步骤(4)离心后的沉淀复溶，并通过超声分散均匀，获得偶氮苯磺酸镍配合物偶联的hbp抗体。
54.进一步的，所述hbp抗体源自羊。
55.本实施例的荧光免疫层析标记物为上述的制作方法制备的偶氮苯磺酸镍配合物偶联的hbp抗体。
56.检测方法：
57.将偶氮苯磺酸镍配合物偶联的hbp抗体结合在试纸条上，通过荧光定量分析检测。
58.检测结果与分析：
59.准确度验证试验
60.分别将实施例1、实施例2、实施例3、对照组1和对照组2的试纸条，重复3次检测hbp参考品(理论浓度50ng/ml)，并计算相对偏差。结果如表1所示：
61.表1准确度验证试验结果
[0062] 实施例1相对偏差实施例2相对偏差实施例3相对偏差对照组1相对偏差对照组2相对偏差152.1254.25％47.3805.24％52.7205.44％43.37613.23％42.96314.07％
248.4343.13％54.7996.60％52.5355.07％58.26516.53％44.75310.94％353.2766.55％53.416.82％51.7833.56％40.74018.52％43.74012.52％
[0063]
由表1检测结果可知，实施例1、实施例2、实施例3各检测结果的相对偏差均小于对照组1与对照组2，表明本发明的荧光免疫层析标记物显著提高了检测的准确度。
[0064]
重复性验证试验
[0065]
分别将实施例1、实施例2、实施例3、对照组1和对照组2的试纸条，重复10次检测hbp参考品(理论浓度50ng/ml)。计算检测结果的平均值和标准偏差，再根据公式(变异系数＝标准差/平均值)计算变异系数验证试纸条的重复性。结果如表2所示：
[0066]
表2重复性验证试验结果
[0067][0068][0069]
由表2检测结果可知，实施例1、实施例2、实施例3检测结果的变异系数明显小于对照组1与对照组2，表明本发明制成的荧光免疫层析标记物相比于现有技术有着更好的重复性。
[0070]
综上所述，本发明对hbp抗体进行偶氮苯磺酸镍配合物偶联后，大大提高了检测的准确性和重复性。
[0071]
应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。