1信号通路抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖

作者：杨超月

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)作为糖尿病最常见的微血管并发症，目前认为是一种慢性炎症、增殖反应性疾病[]，是导致终末期肾衰竭的最常见原因。DN病变机制复杂，迄今尚未完全阐明。鞘氨醇激酶1 (sphingosine kinase 1, SphK1)信号通路与DN的关系近年来已成为研究的热点，SphK1是细胞生物学功能的重要调控分子，在肾间质纤维化过程中发挥肾脏保护作用[]。研究表明，长期高血糖、糖基化终产物、氧化应激等均可激活SphK1，从而介导一系列炎症、增殖反应性疾病的发生、发展[]。糖尿病状态下，SphK1活性增强，不但诱使肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell, GMC)增殖，还可进一步激活活化蛋白1(activator protein 1，AP-1)等核转录因子，从而介导细胞外基质(extracellular matrix, ECM)中纤维连接蛋白(fibronectin, FN)、转化生长因子β1(transformation growth factor β1，TGF-β1)等纤维化成分明显增加[-]。说明DN早期已存在SphK1信号通路的激活。因此，抑制SphK1信号通路，可能成为防治DN发生、发展的一个重要靶标。

白藜芦醇(resveratrol，RSV)是我国传统治疗消渴病症(糖尿病及其慢性并发症)的中药虎杖中提取的一种二苯乙烯类化合物，是虎杖的主要活性成分，由于其功效独特、明显而副作用小，已广泛用于人类的生活保健之中。近年来的研究表明[-]，白藜芦醇具有抗DN的作用，但目前确切的分子作用机制尚不明确。最新研究显示[-]，白藜芦醇通过调节SphK1活性、1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate, S1P)表达，发挥抑制细胞增殖的作用。那么，白藜芦醇抗DN的作用是否与SphK1及下游核转录因子相关呢？目前尚未见到从影响SphK1/AP-1信号通路研究白藜芦醇抗DN作用机制的相关报道。本研究采用高糖诱导的GMC模型，观察白藜芦醇对模型细胞中与细胞增殖相关的成分FN、TGF-β1表达的影响，并进一步研究其对SphK1/AP-1信号通路的影响，以探讨白藜芦醇抑制GMC增殖、抗DN的确切分子机制。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞株

大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1，购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC中国武汉大学)。

1.1.2 药物与试剂

白藜芦醇购自北京伟业科创科技有限公司；SphK1抑制剂(SK-Ⅱ)，购自Merck-Millipore; D-(+)-葡萄糖、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、α-tubulin抗体，均购自Sigma公司；胎牛血清购自Hyclone；DMEM培养基购自Gibco公司；FN一抗购自Santa Cruz Biotechnology; TGF-β1、SphK1一抗购自Cell Signaling Technolosy公司; 辣根过氧化物酶偶合的兔、鼠二抗购自Promega公司; AP-1探针购自上海碧云天生物技术有限公司；EMSA试剂盒购自Invitrogen公司；核蛋白提取试剂盒购自Active motif公司。

1.1.3 仪器

双人单面超净工作台(苏州净化设备有限公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)；冷冻高速离心机(德国Eppendorf公司)；Elx-800型酶标仪(美国BioTek公司)；凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法 1.2.1 细胞的传代与培养

HBZY-1常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养条件为37℃、饱和湿度5% CO2。每2~3 d用含0.03% EDTA的胰酶消化传代，传代后第3~12代的细胞用于实验。消化重悬的GMC稀释成相应的密度，接种至培养板或培养皿中常规培养，细胞生长近融合时，用无血清MEM培养基培养24 h后，再给予不同浓度的药物预处理2 h后，加入含高糖培养基刺激24 h后，收集细胞。

1.2.2 MTT法检测白藜芦醇对GMC细胞活力及增殖的影响

GMC活力可反映GMC增殖的变化情况。以104/孔的密度将GMC细胞接种于96孔板中，按上述方法处理后，加入5、10、20 μmol·L-1 3个不同浓度的药物，每组设6个复孔。GMC培养结束前4 h，每孔加20 μL MTT工作液(5 g·L-1)，继续于37℃温箱培养4 h后，终止培养，小心吸弃孔内培养液，加入150 μL DMSO溶液，振荡混匀10 min，选择570 nm波长，在多功能酶标仪上检测各孔的吸光度值OD570nm，可间接反映GMC细胞数量的变化。

1.2.3 Western blot法检测GMC细胞中FN、TGF-β1、SphK1蛋白表达情况

细胞终止培养后，弃孔内培养基，用冷PBS漂洗细胞2次，吸净PBS，加入去污裂解液，冰上用细胞刮子刮下细胞，收集裂解液至1.5 mL EP管，冰上静置30 min后，离心取上清，用BCA法测定蛋白含量。经5%浓缩胶、8%分离胶SDS-PAGE电泳分离蛋白质，每孔上样20 μg总蛋白。用电转仪将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上。电转后，TBST洗膜3次，每次5 min，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，FN一抗(1 :500)、TGF-β1一抗(1 :1 000)、SphK1一抗(1 :1 000)4℃孵育过夜，次日洗膜后，分别用对应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1 :5 000)室温孵育1 h，洗膜后加入化学发光剂显影。利用图像分析软件Quantity One对目的条带进行灰度分析。

1.2.4 EMSA法测定GMC细胞中AP-1的活性