Flp-in system稳定表达细胞株构建方法- FLP重组酶介导的基因整合

作者：杨超月

研究一个基因的功能，最常规的方法便是过表达（over-expression）和静默（knock-down或者knock-out），一般是通过外源基因转染宿主，进而观察宿主相关的表型（Phenotype）发生的变化（凋亡、增殖、周期、侵袭、迁移、上下游信号通路、EMT等等）来判断基因的功能。
不管是过表达还是静默，细胞水平的研究往往是选择构建稳定细胞株，研究细胞发生的变化。常规的构建稳定细胞株的方法有真核质粒转染、慢病毒包装。慢病毒包装周期较长，费用较高，对实验室硬件条件要求高，极大地限制了他的应用；普通的真核质粒转染周期较长，目的基因整合随机，对宿主要求高等缺点也限制其应用。随着新技术的不断革新，针对真核质粒转染构建稳定细胞株的方法也不断的创新，出现TALEN、IOS、Cas9、Flp-In等技术，不断地提高稳定细胞株构建的成功率。
尤其是Flp-In系统，以其独特的优点，迅速被各大实验室采用，近些年累计发表的文献越来越多，得到广大科研工作者的认可。

Flp-In™ System

For Generating Stable Mammalian Expression Cell Lines by Flp Recombinase-Mediated Integration

Flp-In™ System总览：
Flp-In™完整系统(Flp-In™ Complete System)可使目的基因在哺乳动物细胞基因组的特定位点整合和表达。Flp-In系统(Flp-In System)涉及将Flp重组靶(FRT)位点导入所选哺乳动物细胞系的基因组中。然后通过Flp重组酶介导在FRT位点的DNA重组，将含有目的基因的表达载体整合到基因组中。
Flp-In™系统(Flp-In™ System)的主要组分包括：
1. Flp-In靶位点载体pFRT⁄lacZeo，用于制备含有FRT整合位点的宿主细胞系
2. 含有与潮霉素抗性基因相连的FRT位点的表达质粒，用于在Flp重组酶介导下，整合和筛选表达目的基因的稳定细胞系；目的基因的表达由人巨细胞病毒(CMV)即刻早期增强子⁄启动子调控
3. Flp重组酶表达质粒pOG44，用于在人CMV启动子调控下表达Flp重组酶
4. 含有氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因的对照表达质粒，在与pOG44共转染到Flp-In宿主细胞系中时表达CAT

Flp-In™ System的优点：
1. 一旦成功构建含FRT整合位点的Flp-In母细胞株，接下来构建表达目的基因稳定细胞株的工作就快速、高效；
2. Flp-In系统能构建同基因型的稳定细胞株；
3. Flp-In系统可以是多克隆稳定细胞株，无需纯化。

Flp-In™ System描述：
Flp-In系统依据酿酒酵母的DNA重组系统的特点，高效构建稳定哺乳动物表达细胞株。这种DNA重组系统应用重组酶（Flp）和定点重组技术(Craig, 1988; Sauer, 1994)，将目的基因插入到哺乳动物指定的基因组中。
Flp-In系统运用3种不同的质粒来构建同基因型的稳定细胞株。
pFRT/lacZeo质粒是用来构建Flp-In母细胞株。质粒包含lacZ-Zeocin融合基因，有SV40早期启动子控制表达。FRT位点被插入在lacZ-Zeocin融合基因的ATG起始密码子下游。FRT位点是用来与Flp重组酶结合，进而被剪切。pFRT/lacZeo转染进细胞中，然后通过Zeocin抗生素筛选细胞，阳性克隆细胞即含单一的FRT整合位点。Flp-In母细胞株含FRT位点和表达lacZ-Zeocin融合基因。pFRT/lacZeo质粒整合进入基因组是随机的。
第二个主要的质粒是pcDNA5/FRT表达载体，用来将目的基因克隆进去，目的基因由hCMV启动子控制，载体还有Hygromycin抗体基因，还有5’编码区的FRT位点。Hygromycin抗性基因缺少启动子和ATG起始密码子。
第三个主要的质粒是pOG44载体，用来表达Flp重组酶(Broach et al., 1982; Broach and Hicks, 1980; Buchholz et al., 1996)，由hCMV启动子控制。
pOG44质粒和含目的基因的pcDNA5/FRT质粒共转Flp-In母细胞株，Flp重组酶介导FRT位点的同源重组（母细胞基因组和pcDNA5/FRT），这样pcDNA5/FRT的目的基因插入基因组。同时将Hygromycin抗性基因插入到pFRT/lacZeo的SV40启动子和ATG起始密码子下，抑制了lacZ-Zeocin融合基因的表达。这样的话Flp-In稳定细胞株就可以通过hygromycin耐受、Zeoncin敏感、缺少ß-半乳糖苷酶活性、表达目的基因4个特性去筛选得到。

Flp-In™ System流程图：
下图描述了Flp-In系统的主要流程：

flp-in系统流程图

Flp重组酶介导DNA的重组：
在Flp-In系统中，Flp重组酶介导分子间的DNA重组，Flp重组酶介导的重组有如下特点：
1. 重组发生在特异的FRT位点；
2. 重组很保守，不需要DNA合成，FRT重组位点被保护，使重组位点发生突变的可能性降到最低；
3. 重组仅仅需要34bpFRT位点。
更多关于Flp重组酶和保守位点特异重组请参考文献(Craig, 1988; Sauer, 1994).

FRT位点：
FRT位点最初从酿酒酵母中分离得到，并被深入研究(Gronostajski and Sadowski, 1985; Jayaram, 1985; Sauer, 1994; Senecoff et al., 1985).最短的FRT位点包含34bp序列，包含2个13bp的片段序列，中间8bp序列含Xba I限制性酶切位点，另外13bp重复序列在大多数FRT位点中也有，但是并不是剪切所必须的(Andrews et al., 1985).当Flp重组酶结合到3段13bp的序列上时，剪切发生在中间的8bp区域(Andrews et al., 1985; Senecoff et al., 1985).

实验流程：

将pFRT/lacZeo质粒转染细胞，构建Flp-In母细胞株；

将目的基因克隆进pcDNA5/FRT表达载体；

在Flp-In母细胞中共转pcDNA5/FRT和pOG44质粒，构建出Flp-In表达细胞株；

检测目的基因的表达。

flp-in系统流程图