奥凯生物：多能干细胞技术和基因编辑技术日渐

作者：张馨予

一、人多能干细胞及谱系分化

1998年，美国科学家Thomson成功建立首例hESC。发育至4～5天的受精卵胚胎，此时还是一个中空细胞团，称作囊胚。囊胚由三部分组成：包绕其外层的滋养层细胞，其内的空腔囊胚腔，以及位于囊胚腔一端的数十个细胞组成的内层细胞团。分离的内细胞团在一定条件下进行体外培养，就能得到hESC。hESC可在体外长期维持，并能模拟早期胚胎发育过程，分化为外、中、内三个胚层的细胞谱系。

2007年，hiPSC率先由日本科学家Yamanaka、美国科学家Thomson和美国科学家Daley分别建立。将多能干细胞特征性转录因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 等）导入体外培养的人成纤维细胞，经过一定时间，这些已分化的成体细胞可被逆转至多能干细胞阶段。研究发现hiPSC与hESC一样，具有自我更新和三胚层分化的潜能。与此同时，hiPSC技术的实现也同时克服了hESC在伦理学和异体移植时可能发生免疫排斥的缺陷。

在哺乳动物早期胚胎发育过程中，上胚层细胞经过原肠运动形成三胚层，多个信号通路（包括TGF-β超家族信号、Wnt 家族以及 FGF信号）在这一过程中起着重要作用。这一发育学原理同样在hPSC分化为三胚层细胞谱系的过程中适用。通过激活或抑制TGF-β超家族、Wnt以及 FGF信号，hPSC能被靶向到外、中、内三个胚层，进而分化为成熟的神经细胞、胰腺β细胞、表皮细胞、心肌细胞等，解决了移植细胞供体来源的问题。

二、人多能干细胞基因编辑

与其他细胞种类不同，传统的同源重组方法在hPSC上进行基因编辑效率十分低下，这很大程度上限制了hPSC的应用。位点特异性核酸酶技术的建立，尤其是TALEN与CRISPR/Cas9技术的出现，成功解决了hPSC基因编辑难题。位点特异性核酸酶进行基因编辑的原理均是在DNA特异位点进行切割，造成双链DNA断裂（double strand break, DSB），从而显著提高非同源末端连接（nonhomologous terminal connections，NHEJ）或同源重组（homologous recombination，HDR）进行DNA修复的能力和动力。

CRISPR/Cas9 技术由于其引导gRNA设计简便、省时、系统靶向性好、效率高等特点被广泛应用。目前广泛使用的Ⅱ类CRISPR/Cas9系统由两部分组成：DNA核酸酶Cas9，该酶可被引导与DNA 结合，造成DSB ；gRNA，具有一段保守二级结构，可与Cas9结合，同时可供设计的靶向序列部分通过与DNA特异性结合，将Cas9引导至指定切割位点。如今，CRISPR/Cas9系统已经被广泛地应用于条件基因性敲入与敲除、长片段基因修饰、多基因敲除等领域当中。

三、人多能干细胞分化产物移

植治疗重大疾病的基础与临床

hPSC具有能在体外培养环境中长期分裂增殖以及在特定诱导条件下定向分化为三胚层来源的所有细胞类型的能力，在再生医学的未来发展中被寄予厚望，很多科学家开展了应用hPSC分化产物作为功能性细胞来源，修复受损组织功能及治疗退行性疾病的研究。

在动物模型中，hPSC分化产物移植取得了显著成就。将hPSC分化为内侧神经节隆起（medial ganglionic eminence, MGE）前体，移植后能明显改善癫痫发作和阿尔茲海默病小鼠的学习与记忆能力；分化的外侧神经节隆起（lateral ganglionic eminence，LGE）前体移植后能明显改善亨廷顿病小鼠模型的运动行为异常；分化的中脑多巴胺能神经元前体移植到纹状体后能显著改善帕金森病小鼠或猴模型的运动异常；分化的胰腺β细胞前体移植后，缓解了动物糖尿病症状等。

除基础研究外，有关hPSC分化产物移植的临床研究正在全球范围内如火如荼开展。目前，美国、英国、韩国、以色列、日本等国家正在进行hPSC分化获得的色素上皮细胞移植治疗黄斑变性的临床研究；美国进行了hPSC分化获得的少突胶质细胞治疗脊髓损伤的临床研究；法国正在进行hPSC分化获得的中脑多巴胺能神经元前体移植治疗帕金森病的临床研究。我国同样也在积极推进hPSC分化产物移植的临床研究。当前，我国科学家正在开展hPSC分化获得的中脑多巴胺能神经元前体移植治疗帕金森病的临床研究，并在hPSC分化获得的间充质干细胞治疗重症新冠肺炎中取得较好成效。

四、普适性人多能干细胞分化

产品的制备是推动其临床应用的关键

神经分化与再生领域专家、美国威斯康星大学麦迪逊分校的著名华人科学家张素春教授最近在Nature Medicine 发表论文，将猴iPSC分化获得的中脑多巴胺能神经元前体进行自体移植或同种异体移植，发现自体移植组在无免疫抑制剂处理的情况下，帕金森病症状显著改善，而同种异体移植组未取得理想疗效。这一方面证实了细胞移植在治疗神经退行性疾病中的技术优势，另一方面也再次表明了免疫排斥仍然是需要考虑的瓶颈问题。2020年5月，NEJM 报道了哈佛大学研究团队进行首例自体hiPSC来源的中脑多巴胺能神经元前体纹状体移植治疗帕金森病的案例。将病人成体细胞重编程为自体hiPSC，通过病人外周血单个核细胞重构人源化小鼠，验证了自体hiPSC的低免疫原性，质控后将自体hiPSC 分化为中脑多巴胺能神经元前体并进行双侧纹状体移植，病人帕金森病症状在移植后18～24个月明显改善。此个例无疑给hPSC的细胞移植治疗注入了一支强心剂，但个性化治疗费用高昂，因此制备普适性且低免疫原性的人多能干细胞分化产品是推动hPSC临床应用的关键。