手把手教你设计PCR引物详解

作者：张馨予

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对于刚接触分子生物学实验的小伙伴们来说，如果做一些与基因相关的实验的话，肯定离不开最基础的实验——PCR，目前大家使用PCR技术做的最多的就是对基因/物种的鉴定、基因的克隆、基因表达量测定等实验。

今天小编将从最简单的基因的鉴定来介绍PCR的引物设计。

引物设计原则：

1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；

2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近，一般Tm值不超过 5℃。

3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间，最好为 72℃左右。

4、引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰，且 3’端的碱基一般不用A；引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败，

5、碱基要随机分布，且引物自身和引物之间 不能有连续4个碱基的互补。

6、尽量在基因的编码区 （CDS序列）上设计引物，限制基因组DNA扩增。

7、使用BLAST检索，确认引物特异性。

1 引物设计

1.1 基因的确定

打开NCBI网址https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，下载你所需要鉴定的Gene Symbol，这里以微生物基因 opaR 为例。

1.2 复制基因序列

点击GenBank(针对基因序列)，复制下面的基因的序列。

2 Primer Premier 5设计引物

2.1 载入基因序列

通过File下的New或Open载入需要设计引物的DNA序列，如下图示。

2.2 Primer 设置

点击上图的primer选项，出现右图这个界面，再点击search。

2.3 参数设置

主要有五个要设置的地方。

第一栏是选择设计PCR引物，测序引物和杂交探针，这里选择第一个“PCR Primers”；第二栏是搜寻类型，一般我们搜索引物是以对搜索，所以一般选"pairs"；第三栏是正负链的所在区间以及产物的大小长度，这里是介绍基因的鉴定的，一般以默认的参数就可以了，不过可以根据实验的需求自行设定；第四栏是引物的长度以及正负波动值，一般来说引物长度在 18-27℃范围内；第五栏是选择模式，一般选 “Automatic”。

设置完上面所说的这些地方后按“OK”键，则跳转到新界面，在点击OK。

2.4 选择合适的引物

该图左上角这两个按钮和分别代表的是正向和反向引物。该图中间部分给出了引物的得分，位置，长度，Tm值，GC含量，自由能等信息。该图最下面的模块给出了正反引物是否形成发夹结构，二聚体，错配以及引物之间的二聚体等情况，红色代表有。

2.5 修改引物