同源建模和分子对接揭示甜菊糖苷糖基化关键酶

作者：杨超月

同源建模和分子对接揭示甜菊糖苷糖基化关键酶SrUGT76G1的构效关系

2021-12-21 08:22 来源: 武哥说生活

原标题：同源建模和分子对接揭示甜菊糖苷糖基化关键酶SrUGT76G1的构效关系

甜叶菊Stevia rebaudiana (Bertoni)Hemsl. 为菊科（Asteraceae ）甜叶菊属Stevia L. 多年生草本植物，为药食两用植物，主要药食部位为干燥叶片，是继甘蔗、甜菜之后的第3 种天然甜味剂[1-2]。我国目前已成为世界第一大甜叶菊种植国、生产国和出口国，约占世界市场的90% [3]。甜叶菊叶片的甜味主要来源于甜菊糖苷（stevia glycosides ，SGs ），其混合物甜度相当于蔗糖的250 ～300 倍，但所含热量仅为蔗糖的1/300 ，故具有高甜度、低热量等优点[4-7]。目前，甜菊糖苷的安全性已得到联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations ，FAO ）和世界卫生组织（World Health Organization，WHO）等国际组织的认可，是饮料、食品、医药及日用化工等领域的理想甜味替代剂[8-11]。我国卫生部于1985 年和1990 年分别批准甜菊糖苷作为不限量使用的天然甜味剂和医药用甜味剂辅料[12]。

1材料与试剂

1.1 材料

课题组前期研究SrUGT76G1 基因的2 个变异序列NO2 序列和NO3 序列[18] 。甜叶菊材料经四川农业大学吴卫教授鉴定为甜叶菊S. rebaudiana (Bertoni) Hemsl. ，命名为“110 ”和“B1188 ”，材料种植于四川农业大学成都校区实验圃。

1.2 试剂

大肠杆菌菌株DH5α 和BL21 （DE3 ）（TsingKe 公司，北京）；克隆载体Pclone007 blunt vecter （TsingKe 公司，北京）；原核表达载体pET-28a （＋）由本实验室保存；总RNA 提取试剂盒-E.Z.N.A. ®Plant RNA Kit （OMEGA Bio-Tek ，美国）；反转录试剂盒-Hi ®IIQ RT SuperMix for qPCR （＋gDNA wiper ）Kit （Vazyme 公司，南京）；基因克隆试剂盒-Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase （Vazyme 公司，南京）；酶切所用酶- Bam H I和Hin d III（Takara 公司，日本）；DNA 胶回收试剂盒-Gel Extraction Kit （100 ）（OMEGA 公司，美国）；同源重组试剂盒-ClonExpressTM IIOne Step Cloning Kit （Vazyme公司，南京）；聚丙烯酰氨凝胶电泳试剂盒-10% 聚丙烯酰氨凝胶电泳预混液试剂盒（新赛美公司）；50 mg/mL 异丙基-β- D - 硫代半乳糖苷（IPTG ）溶液（Solarbio 公司，北京）。

2方法

2.1 RT-PCR克隆甜叶菊材料中SrUGT76G1变异序列

RT-PCR 克隆SrUGT76G1 及其变异序列筛选参照Zhang 等[18]报道相关方法。

2.2各变异序列功能验证及其催化效率比较

由于SrUGT76G1 参与糖苷1,3-β- D - 葡萄糖苷键的形成，因此选择双糖苷甜菊双糖苷（steviolbioside ）和甜茶苷、3 糖苷甜菊糖苷（stevioside，ST）以及5 糖苷莱鲍迪苷D（rebaudioside D，RD）分别作为底物，其中甜菊双糖苷理论上可在其C 13 位的第1 个和第2 个葡萄糖基上形成1,3-β- D - 葡萄糖苷键，甜茶苷和ST 理论上可在其C 13 和C 19 位的第1 个葡萄糖基上形成1,3-β- D - 葡萄糖苷键，RD 理论上可在其C 19 位的第1 个葡萄糖基上形成1,3-β- D - 葡萄糖苷键（图1 ）。这4 种糖苷底物可实现SrUGT76G1 的各变异序列对糖苷C 13 和C 19 催化偏好以及糖基数量对其催化效率影响的考察。

同源建模和分子对接揭示甜菊糖苷糖基化关键酶

2.3 变异序列的同源建模及其与甜菊糖苷对接

3 结果与分析

3.1 SrUGT76G1 基因在110和B1188材料中序列比较分析