细胞培养常见污染

作者：张馨予

细胞被污染? 同学，你不是一个人!

不管是新手还是老手，没有经历过过细胞污染的人一定不是一个合格的细胞饲养员，

如何成为一个养细胞的“老司机”呢?

你只要做到——遇到细胞被污染时，面不改色心不跳，反手就能处理好!

我们先来看看污染的真面目，总结下来无非以下几种类型：

细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、真菌污染、支原体污染、黑胶虫污染、原虫污染、病毒污染以及非细胞污染。

怎样判断你的细胞是何种生物性污染?

细菌

细菌种类繁多，分布广泛，是最容易污染细胞的微生物。

1、常见细菌种类为大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌等(革兰阴性菌)、葡萄球菌等(革兰阳性菌)，其中革兰阳性菌较为多见。

2、主要来源：操作不当或是器材消毒不严，或是各种营养成分隐性污染细菌没有被检测出来所造成的。

3、特点：污染速度快，易被发现。多数情况下细胞培养液短时间内变黄，培养基1～2d就会变浑浊，pH值降低，倒置显微镜下观察，可见胞浆出现大量颗粒，细胞变圆或崩溃，从壁上脱落，培养液中有大量圆球状颗粒物漂浮，呈细沙状，污染较轻时可见小菌体在细胞间运动。

4、处理措施

①在培养液中添加双抗（P/S）处理；可用抗生素的常用量的5~10倍作冲击疗法，用药24~48h后再换常规培养液；

②另外添加西司他丁钠和亚胺培南处理细胞，适用于培养用具被打翻、使用了污染的培养液或要培养污染的组织或者冻存细胞的污染情况。

③裸鼠体内接种法是比较有效和彻底的除菌方法。主要包括腹水接种和皮下荷瘤分离细胞。既能彻底清除污染细菌，又能保持肿瘤细胞的来源特征和恶性特性。对于一些特别珍贵的肿瘤细胞，可采用裸鼠体内接种法。

5、举例

图1 小鼠胃癌细胞的球菌感染（细菌污染）

细胞培养常见污染

图2 革兰氏阴性菌（洋葱佰克霍尔德菌）

洋葱佰克霍尔德菌（Burkholder acepacia）原属假单胞菌属，是植物病原菌，因引起洋葱患病而得名，是医院感染病原菌之一。

洋葱伯克霍尔德菌是一种广泛存在于土壤及水中，与医院感染密切相关的革兰阴性杆菌，尤其为免疫缺陷及肺囊性纤维化患者易感染细菌之一。它可以在无糖的培养基中生长。在医院环境中常可污染自来水、体温表、喷雾器、静脉导管、导尿管、静脉输液管等，造成院内传播，导致多种医院感染，如败血症、心内膜炎、肺炎、伤口感染、深部脓肿和眼结膜炎等，尤其采用导管植入进行治疗者，更容易引起感染。洋葱伯克霍尔德菌对多种抗菌药具有天然的耐药性。耐药现象严重，治疗可选择复方磺胺甲繟唑、哌拉西林,三唑巴坦、哌拉西林和头孢他啶等抗菌药物。

真菌

1、真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其是在梅雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。

2、主要来源：实验人员(实验服)

3、特点

短期内不会引起培养液的浑浊，可在培养液中形成白色或黄色漂浮物，一般肉眼可见，较易被发现，4d左右才可在高倍镜下观察到丝状、管状或树枝状菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。

念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间（发生卵圆形物体污染的几率很大）。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落而亡。

4、处理措施

① 添加制霉菌素和两性霉素B，但是对细胞的毒性也较大；

② 环境彻底消毒：先后用酒精、新洁尔擦洗培养箱；水盘加上饱和量的硫酸铜。

③ 若细胞不是特别珍贵，建议丢弃。

5、举例

图3 白色念珠菌污染