Brain：帕金森病的发病新机制

作者：杨超月

　　导读：

　　帕金森病的特征是黑质致密部内多巴胺能神经元进行性变性，存活的神经元存在蛋白聚集体。LRRK2 G2019S突变是家族性帕金森病病例的主要决定因素之一，并导致具有多形性病理的晚发性帕金森病，包括a-突触核蛋白积累和蛋白包涵体的沉积。Brain期刊（IF=13.501）近期发表了题为《LRRK2 G2019S kinase activity triggers neurotoxic NSF aggregation》的研究论文，作者团队报道了LRRK2可磷酸化 N-乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)，并在携带G2019S变异的帕金森病患者的基底神经节标本以及表达LRRK2 G2019S变异的细胞和动物模型中观察到含有NSF的聚集体，而且LRRK2 G2019S激酶活性诱导NSF在毒性聚集体中的积累，同时自噬诱导下可清除NSF聚集，挽救在老年hG2019S小鼠中观察到的运动和认知障碍。研究人员认为LRRK2 G2019S病理性磷酸化影响NSF生化特性，从而引起细胞毒性蛋白包涵体的形成，贡献于帕金森病的发病。

　　hG2019S小鼠的年龄依赖性运动和认知障碍

　　作者前期研究描述了hG2019S BAC (hG2019S)小鼠中年龄依赖性的神经病理和行为表型。在一组行为测试中对年龄匹配的野生型和hG2019S雄性小鼠在3、6、12和18个月时进行了表征，包括自发运动活动（图1A、B）、平衡木、爬杆实验、转棒试验（图1 C-G）和新物体识别（1H)，而自发活动在基因型之间没有差异。3月龄野生型和hG2019S队列在所有实验中的表现相同，但在32 rpm转棒试验中，hG2019S小鼠显著受损。我们注意到，hG2019S小鼠在6个月平衡木和爬杆试验、12个月和18个月转棒(12 rpm)、6个月和18个月转棒(32 rpm)以及6个月和12个月转棒阻力试验时的运动能力受损。最后，6、12和18月龄hG2019S小鼠在新物体识别测试中的平均辨别指数评分显著较差。这些观察结果表明，6月龄hG2019S小鼠表现出运动和认知障碍。

　　图1 hG2019S小鼠的年龄依赖性运动和认知障碍

　　G2019S突变与NSF聚集体的沉积相关

　　蛋白质聚集是帕金森病公认的组织学标志，而LC3修饰帕金森病和路易体痴呆患者的路易体。于是作者通过LC3抗体染色研究6月龄野生型和hG2019S雄性小鼠黑质、纹状体、皮质和海马标本中蛋白聚集体的存在。路易小体和相关的核内包涵体包含90多个分子，包括NSF，因此将其描述为LRRK2功能伴侣，并分析了NSF在hG2019S皮层神经元中的亚细胞分布。作者发现NSF定位于LC3和p62阳性的体细胞结构（图 2AB），即类似蛋白聚集体。蛋白聚集体形成高分子量复合物，在滤过阻滞试验中被醋酸纤维素保留；并证实6月龄hG2019S小鼠大脑制备的样本中存在NSF高分子量复合物（图 2 CD）。蛋白质聚集体的一个公认特征是对蛋白酶K消化的抵抗力，于是通过收集6月龄野生型和hG2019S小鼠的脑匀浆中有限的蛋白水解来表征NSF聚集体。经蛋白酶K消化，100 kDa分子量条带，对应于全长NSF蛋白，在野生型而非hG2019S小鼠制备的样品中逐渐消失（图 2EF）。组织学分析还发现6月龄hG2019S小鼠制备的黑质、纹状体、海马和皮质切片中存在NSF阳性聚集体（图 2GH）。

　　图2 HG2019S小鼠中的NSF聚集

　　接下来作者对从健康对照、特发性和G2019S帕金森病病例中获得的死后基底神经节标本进行了表征。从生物化学的角度来看，洗涤剂的溶解度曲线表征了蛋白质聚集体。有趣的是，各组TBS可溶性NSF水平相当（图 3AC），而特发性或G2019S帕金森病患者制备的样品中SDS-可溶性部分NSF的产量较高（图 3BD）。此外，在特发性和G2019S帕金森病病例中，发现NSF修饰了一部分a-突触核蛋白阳性结构（图 3E）。通过滤过阻滞试验，作者注意到NSF在G2019S多巴胺能神经元中制备的样品中可形成高分子量复合物（图 3FG）。以上证据表明，在鼠和人体模型中，LRRK2 G2019S突变与NSF聚集体的沉积相关。

　　图3 在人源性样本中的NSF聚合

　　LRRK2 G2019S激酶活性触发NSF聚集

　　作者团队研发了专门识别在THR645的NSF磷酸化的抗体，可见G2019S患者标本采集的死后样本中Thr645位点的NSF磷酸化增加（图 4AC），NSF聚集在6月龄hG2019S小鼠的几个脑区（图 4DE）。NSF的结构分析(Protein Data Bank ID：3J94)发现，T645的侧链靠近参与NSF寡聚化的D2结构域上的ATP结合位点[氨基酸(aa)490-744]（图 4FG）。通过差异洗涤剂溶解度试验，发现从hG2019S皮层神经元收集的不溶性部分中NSF量增加（图 4HI）。因此，作者认为其他机制必须是LRRK2 G2019S依赖性NSF聚集的基础。除此以外，磷酸化可能直接影响蛋白质折叠和低聚状态。为了解析NSF在Thr645上磷酸化的生物学结果，通过定点直接诱变产生了NSF拟磷酸化变体NSF T645D。NSF T645D在不溶性部分强烈富集，表现为洗涤剂溶解度的差异（图 4JK）。引人注目的是，一旦与血凝素(HA)-NSF野生型共表达，NSF T645D影响野生型蛋白的溶解度（图 4JL）。以上观察结果表明，T645的磷酸化可触发NSF聚集。一旦包埋在聚集体中，蛋白质则被泛素切割和标记。western blotting分析发现，NSF T645D发生蛋白水解切割，并被泛素强烈修饰（图 4MO)。在泛素链中，每个单体可以通过不同的赖氨酸残基偶联，生成功能性编码。