慢病毒载体的前世今生及安全性探讨

作者：张馨予

慢病毒（Lentivirus）载体是一种单链RNA病毒，是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，能够感染分裂和非分裂细胞。由于其可以将外源片段随机插入细胞基因组，因此可以在体内较长期表达目的基因，且免疫原性低、安全性高，是重要的基因操作工具。吉凯基因提供的慢病毒为“**性”病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。

一、慢病毒（HIV-1）的基因组

HIV病毒基因组由两条正义链的RNA组成，约9kb的序列编码了9个蛋白，分别是gag、pol、vif、vpr、vpu、env、tat、rev、nef。其中三个最大的阅读框编码了三个最主要的结构蛋白：gag、pol和env。

gag基因编码了HIV的核心蛋白，包含有基质蛋白MA、衣壳蛋白CA（P24）、核衣壳蛋白NC以及p6；pol基因编码了HIV复制所需的一系列酶，分别是蛋白酶（PR）、逆转录酶（RT）、整合酶（IN）。env基因编码病毒表面糖蛋白gp160，gp160剪切成为表面蛋白gp120（SU）和跨膜蛋白gp41（TM），这两个蛋白共同构成了HIV病毒的外层膜蛋白。

除了这几个主要基因，HIV病毒基因组还编码调节蛋白tat和rev。Tat蛋白能够激活病毒的转录，而rev蛋白则控制病毒转录本的剪接和出核。另外还有四个基因编码病毒辅助蛋白vif、vpr、vpu和nef。HIV基因组两侧各有1个LTRs（长末端重复序列），该序列对于慢病毒的转录，逆转和整合进入宿主细胞的基因组是必须的。病毒基因组的二聚化及包装信号ψ位于5‘LTR和gag基因之间。

图1. HIV-1病毒基因组

二、 HIV-1的感染过程

HIV表面蛋白SU和其受体CD4及共受体CXCR4或者CXCR5结合，开启整个感染过程。

当完成受体识别之后，TM将改变构像，促进HIV的包膜与细胞膜融合，最终导致病毒核心粒子进入细胞内。进入细胞后，衣壳蛋白解体，释放出RT、IN等酶到细胞质。正义链的RNA被RT酶转化为双链DNA。随后该前体病毒DNA被转运进入细胞核，并被整合进入细胞基因组。

三、HIV的成熟过程

病毒基因组整合进入细胞基因组后，在LTR的作用下起始病毒基因组的转录，并完成5’加帽和3’加尾过程。5’端的LTR具有一定的启动子活性，能够利用宿主细胞的RNA pol II进行转录。在缺乏病毒转录激活因子Tat的情况下，5’LTR的转录活性非常微弱。此时病毒转录产物进行多重剪接形成短转录本。这些短转录本编码非结构蛋白tat和rev。

tat蛋白与病毒的LTR结合后将会促进病毒所有基因转录本的表达，而rev蛋白通过结合转录本上的RRE（Rev-responsive element）来增强病毒的mRNA的出核转运，并促进单剪接mRNA和无剪接mRNA的成熟。单剪接转录本将编码env、vif、vpr、vpu，而无剪接mRNA被用于翻译gag、pol基因，并可以被用于作为子代病毒的基因组RNA（图2）。

图2

四、HIV-1病毒改造为慢病毒载体

目前常用的慢病毒包装系统主要是第二代慢病毒包装系统和第三代慢病毒包装系统。在这部分我们将详细介绍第二代和第三代慢病毒包装系统如何通过改造以提高其生物安全性和感染效率。

1. 早期的HIV-1载体

最早期的慢病毒载体是可以复制的，只是携带了目的基因。不过该载体主要是用于进行anti-HIV的研究。随后，为了使该载体更为安全，病毒的元件被分离进入了两个质粒：（1）一个质粒包含HIV所有的除去env基因的前病毒DNA；（2）一个质粒表达env。