腺病毒载体的研究及应用进展

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

病毒载体能够携带外源基因并包装成感染性病毒颗粒，介导外源基因的转移和表达。腺病毒载体转导目的基因具有高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点，被认为是最有效的转基因载体之一，哺乳动物来源的各种腺病毒被广泛用于基因治疗、肿瘤治疗及疫苗研发等领域。此文对腺病毒载体的特点及研究进展做一综述。

正文

利用载体将基因导入细胞，比非病毒的转移方法如阳离子聚合物-DNA复合物更有效。腺病毒（adenovirus，Ad）载体基因组大小适中、易于基因重组操作、繁殖滴度高、宿主范围广、安全性好，可改造为复制缺陷型病毒载体用于疫苗研究，也可以改造成选择性复制的溶瘤病毒（oncolytic virus，OV）载体用于肿瘤治疗。Ad载体本身可发挥佐剂效应，无需佐剂即可有效诱导体液免疫和细胞免疫，还可通过黏膜免疫（口服、鼻腔或者雾化吸入）接种，是理想的疫苗载体。Ad载体在体内基因转导、疫苗研制和基因治疗等领域有广泛的应用前景 [1] 。

生物学性状

1.1

结构

Ad为无包膜线性双链DNA病毒，基因组全长25～45 kb，两端各有长100~150 bp的末端反向重复序列（inverted terminal repeats sequence，ITR），左端ITR的3’端长约300 bp的包装信号是Ad复制包装所必需的顺式作用元件。根据病毒DNA复制顺序，可将其基因分为早期和晚期转录单元。早期转录单元表达与病毒复制有关的E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4区基因，E1区缺失可使病毒无法继续复制，E2区产物是晚期转录单元表达的反式因子和复制必需因子，E3为复制非必需区，其缺失可扩大插入容量。晚期转录单元表达与Ad颗粒组装相关的L1—L5区基因。

Ad基因组示意图见图1。

Ad的病毒颗粒直径80～100 nm，相对分子质量约175 000。病毒衣壳呈20面体立体对称结构，主要由252个衣壳体组成，包括240个六邻体和12个五邻体。六邻体基底保守，在Loop1、Loop2变异区中有7个高变区，是中和抗体的主要作用靶点。五邻体位于衣壳的顶角，由五邻体基座和纤维组成，每个顶角处伸出一根纤毛突起，其末端有一个结节区。多肽Ⅳ主要构成病毒三聚体纤突，与病毒血凝活性相关，具有型特异性。外源抗原表位可以插入六邻体、五邻体基底蛋白、纤维蛋白和多肽Ⅸ，但不影响病毒结构的稳定性和功能，并且可以诱导特异性免疫应答。

人Ad（human Ad，hAd）已鉴定并分离100多个血清型，分为A—G 7个亚群，分别可感染人的呼吸道、胃肠道和眼部等 [2] 。基因治疗和疫苗研发常用的hAd2及hAd5在血清学分类上都属C亚群，主要感染呼吸道引起上呼吸道感染和肺炎，二者的增殖能力非常强，滴度通常可达10 9 噬斑形成单位/ml，在单个细胞中的拷贝数可达10 4 （约占细胞总DNA的10%）。

1.2

感染与复制

Ad感染具有普遍性，各个年龄段人群均能被Ad感染，因此健康人群中抗Ad抗体的血清阳性率较高，且随着年龄的增长逐渐增加 [3] 。Ad可感染人体的多种组织细胞包括高度分化的组织细胞，并在细胞内复制产生子代病毒。Ad有明显的种属特异性，如野生型hAd5虽然可以感染其他的非人类细胞（如鼠类细胞），但只能形成一些不成熟的病毒颗粒，不能再次感染细胞。

Ad五邻体纤毛的结节区可与细胞表面的柯萨奇Ad受体（Coxsackie Ad receptor，CAR）结合，黏附至细胞表面开始感染细胞，CD46、桥粒黏蛋白2和唾液酸受体等其他受体参与B或D亚群Ad对宿主细胞的感染。随后，五邻体基部由5个三肽序列（精-甘-天门冬氨酸）构成的结构域与细胞表面的αⅤβ3和αⅤβ5整合素结合，通过受体介导的胞吞作用进入细胞，脱离质膜形成胞内体。在低pH环境下，Ad衣壳的构象发生变化，病毒逃离胞内体 [4] 。另一个影响逃离胞内体的因素是病毒本身，五邻体上的纤毛与细胞结合后，在胞吞过程中解离 [5] ，纤毛蛋白充当了胞内体膜裂解的pH依赖性触发器 [6] 。蛋白酶也是Ad进入宿主细胞所必需的，未经蛋白酶加工的Ad衣壳（未成熟衣壳）在pH5的环境下无法进入细胞 [7] 。进入细胞后，病毒DNA在核膜上脱壳，通过核孔进入细胞核，复制、组装并释放成熟病毒。

Ad载体技术

基因表达载体和基因工程药物载体主要有非病毒载体和病毒载体两大类，大部分基因治疗采用病毒载体，以Ad、慢病毒、腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）、逆转录病毒载体最为常用，其他还有单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV)、痘病毒和巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）载体等。