基于转座子的免疫细胞的修饰的制作方法
基于转座子的免疫细胞的修饰1.相关申请的交叉引用2.本技术要求2019年2月8日提交的62/803,142的优先权，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。3.序列表的引用4.本技术涉及在2020年1月28日创建的名称为st25_20200128，长度为889,000字节的txt文件中公开的序列，该文件通过引用并入本文中。
背景技术：
：：5.免疫细胞的遗传修饰可用于修饰其特性。遗传上可修饰的免疫细胞特性包括免疫细胞识别的分子、免疫细胞内的细胞应答、免疫细胞在某些环境条件下存活的能力、以及免疫细胞产生的蛋白质。免疫细胞的遗传修饰可用于改善它们的疾病靶向应答。通过增强特异性免疫细胞的功能，可以增强免疫应答，例如以实现长期癌症消退。6.免疫细胞的稳定遗传修饰可以通过将异源多核苷酸整合到免疫细胞的基因组中来进行。可以以不同的方式将异源dna导入免疫细胞：通过用裸质粒dna转染、通过将dna包装到用于感染免疫细胞的病毒颗粒中、或通过将转座子及其同源转座酶导入免疫细胞中。7.非病毒载体系统，包括质粒dna，通常遭受低效的细胞递送、显著的细胞毒性和有限的转基因表达持续时间，这是由于缺乏基因组插入和导致载体在转染细胞群体中的降解和/或稀释。通过非病毒方法递送的转基因通常形成长的重复阵列(串联体)，其是通过异染色质形成进行转录沉默的靶标。8.病毒包装通常对可插入病毒载体的dna的大小施加限制。一些病毒(例如aav)作为非复制附加体(non-replicatedepisome)保留，因此在细胞分裂时稀释。对于将其基因组整合到靶细胞基因组中的病毒，存在关于病毒整合位点的安全性问题。对于所有的病毒递送方法，都存在关于病毒制造的成本和病毒组分的潜在免疫原性的问题。9.转座子(transposon)提供了另一种递送系统，它与裸dna一样制造简单且无免疫原性，但在整合到靶细胞基因组中方面非常有效。转座子包含被转座酶识别的两个末端。转座酶作用于转座子以将其从一个dna分子上切除并将其整合到另一个中：该过程称为转座(transposition)。转座酶将两个转座子末端之间的dna随转座子末端一起转座。异源dna侧翼为一对转座子末端，使得其被转座酶识别并转座，在本文中称为合成转座子(synthetictransposon)。将合成转座子和相应的转座酶导入真核细胞的核中可导致转座子转座到细胞的基因组中。转座子/转座酶基因递送平台具有克服裸dna和病毒递送限制的潜力。特别地，piggybac样转座子(piggybac-liketransposon)由于其无限的基因载量(genecargocapacity)而具有吸引力。10.在整合到细胞基因组中的多核苷酸上编码的基因的表达水平取决于该多核苷酸内的序列元件的构型。整合的效率和因此整合到每个基因组中的多核苷酸的拷贝数、以及发生整合的基因组基因座也影响多核苷酸上编码的基因的表达水平。通常可通过将多核苷酸置于转座子中来增加多核苷酸可整合到靶细胞基因组中的效率。11.通过piggybac样转座酶的转座是完全可逆的。转座子在受体dna分子中的整合靶序列处整合，在此期间靶序列在转座子反向末端重复序列(itr)的每个末端重复。随后的转座去除转座子并将受体dna恢复到以前的序列，同时去除靶序列复本和转座子。然而，这不足以从已整合转座子的基因组中去除转座子，因为很可能将转座子从第一整合靶序列中切除，但被整合到基因组中的第二整合靶序列中。另一方面，缺乏整合功能的转座酶可以从第一靶序列上切除转座子，但不能整合到第二靶序列中。因此，整合-缺陷型转座酶可用于逆转转座子的基因组整合。技术实现要素：12.本发明的一个方面是能够稳定修饰免疫细胞基因组的转座子。本发明的一个方面是有利地修饰免疫细胞以增强其功能的基因。本发明的一个方面是用于修饰免疫细胞以增强其功能的方法。13.描述了修饰免疫细胞基因组的方法。免疫细胞包括淋巴细胞如t细胞和b细胞以及天然杀伤细胞、t辅助细胞、抗原呈递细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞。修饰包括增强免疫细胞在某些条件下或在某些环境中存活和/或增殖的能力，改变免疫细胞表面上表达的蛋白质的量或类型，以及改变免疫细胞对接触细胞的蛋白质或小分子的应答。提供了用于影响免疫细胞的基因组修饰的多核苷酸构建体的序列并且是本发明的一个方面。14.提高人t细胞功能、稳定性(persistence)和增殖能力是目前肿瘤免疫治疗的瓶颈。高度需要允许t细胞的改善的性能、扩增和遗传操作的技术。控制和扩增t细胞的能力具有许多应用，包括以下：(i)改善t细胞疗法的功能以获得例如与car-t组合的更高的功效和/或安全性。(ii)逆转肿瘤浸润性t细胞的t细胞耗竭和/或再刺激诱导的细胞死亡，使t细胞在肿瘤微环境中存活并发挥功能。(iii)改善用于临床前研究(体内)的小鼠中人t细胞的存活。(iv)抗原特异性t细胞的鉴定和体外t细胞受体的克隆。(v)开发可离体维持并且仍执行t细胞的生物学功能(例如细胞杀伤)的t细胞系。15.免疫细胞存活增强基因(immunecellsurvival-enhancinggene)包括抗凋亡基因如生存素、bcl2、bcl6、bcl-xl和编码正常凋亡通路的突变体的基因，该突变体发挥显性负性作用，如casp3、casp7、casp8、casp9或casp10.的显性负性突变体。免疫细胞存活增强基因还包括stat3的激活突变体，包括包含以下突变之一的stat3突变体：f174s、h410r、s614r、e616k、g618r、y640f、n647i、e652k、k658y、k658r、k658n、k658m、k658r、k658h、k658n、d661y或d661v。免疫细胞存活增强基因还包括cd28的激活突变体，包括包含以下突变之一的cd28突变体：d124e、d124v、t195i或t195p。免疫细胞存活增强基因还包括rhoa的激活突变体，包括包含以下突变之一的rhoa突变体：g17v或k18n。免疫细胞存活增强基因还包括磷脂酶cγ的激活突变体，包括包含以下突变之一的磷脂酶cγ突变体：s345f、s520f或r707q。免疫细胞存活增强基因还包括stat5b的激活突变体，包括包含以下突变之一的stat5b突变体：n642h、t648s、s652y、y665f或p267a。免疫细胞存活增强基因还包括ccnd1的激活突变体，包括包含以下突变之一的ccnd1突变体：e36g、e36q、e36k、a39s、s41l、s41p、s41t、v42e、v42a、v42l、v42m、y44s、y44d、y44c、y44h、k46t、k46r、k46n、k46e、c47g、c47r、c47s、c47w、p199r、p199s、p199l、s201f、t285i、t285a、p286l、p286h、p286s、p286t或p286a。16.免疫细胞存活增强基因还包括增强型信号传导受体(esr)，其中esr包括衍生自通常向免疫细胞传递抑制信号的受体的胞外结构域的序列、衍生自向免疫细胞传递刺激信号的受体的胞内结构域和跨膜结构域的序列。示例性胞外结构域包括选自tnfrsf3(ltrβ)、tnfrsf6(fas)、tnfrsf8(cd30)、tnfrsf10a(dr4)、tnfrsf10b(dr5)、tnfrsf19(troy)、tnfrsf21(dr6)和ctla4的人蛋白，例如seqidno：322-340。示例性胞内结构域包括选自以下的人蛋白：tnfrsf4(ox40)、tnfrsf5(cd40)、tnfrsf7(cd27)、tnfrsf9(4-1bb)、tnfrsf11a(rank)、tnfrsf13b(taci)、tnfrsf13c(baff-r)、tnfrsf14(hvem)、tnfrsf17(cd269)、tnfrsf18(gitr)、cd28、cd28h(tmigd2)、诱导型t细胞共刺激因子(icos/cd278)、dnax辅助分子1(dnam-1/cd226)、信号转导淋巴细胞激活分子(slam/cd150)、t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域(tim-1/havcr-1)、干扰素受体α链(ifnar1)、干扰素受体β链(ifnar2)、白细胞介素2受体β亚基(il2rb)、白细胞介素2受体γ亚基(il2rg)、肿瘤坏死因子超家族14(tnfsf14/light)、自然杀伤细胞2族成员d(nkg2d/cd314)和cd40配体(cd40l)，例如seqidno：341-364。示例性的跨膜结构域包括选自365-396的人蛋白。示例性增强型信号传导受体包括这样的序列，其包含选自seqidno：274-318的序列。17.优选地，使用转座子载体向免疫细胞提供免疫细胞存活增强基因。转座子通过相应的转座酶有效地整合到免疫细胞基因组中。几种不同种类的转座子可用于将基因整合到免疫细胞的基因组中。piggybac样转座子，例如包含含有seqidno：18和19的itr序列的菜蛾piggybac转座子、或包含含有seqidno：20和21的itr序列的piggybat转座子、或包含含有seqidno：6和7的itr序列的爪蟾piggybac样转座子、或包含含有seqidno：14和15的itr序列的家蚕piggybac样转座子均可被相应的转座酶转座到免疫细胞基因组中。而且，mariner型转座子如睡美人，其包含含有seqidno：26和27的itr，可以被相应的转座酶转座到免疫细胞基因组中。而且，hat型转座子如tcbuster，其包含含有seqidno：399和400的itr，可以被相应的转座酶转座到免疫细胞基因组中。任何这些转座子可用于将存活增强基因整合到免疫细胞基因组中。可以用相应的转座酶将转座子导入免疫细胞。转座酶可以作为蛋白质提供，或者作为编码转座酶的核酸提供，如mrna分子或dna分子,其具有与可在免疫细胞中表达的启动子可操作地连接的编码转座酶的序列。也可以将其他基因导入免疫细胞以修饰其功能。例如，可以导入编码允许免疫细胞与靶细胞表面上的抗原结合的受体的基因。还可以导入可用于杀伤免疫细胞的基因。使用转座子将基因组合递送到免疫细胞的益处是转座酶通常将转座子itr之间的所有dna整合到免疫细胞的基因组中。因此可以同时导入多个基因。18.将免疫细胞存活基因整合到免疫细胞前体细胞如干细胞的基因组中，然后使免疫细胞前体细胞分化为免疫细胞是可行的。明确地考虑了这样的操作。为了增强免疫细胞的存活，应将存活增强基因可操作地连接至启动子，使得存活增强基因可在免疫细胞中表达。示例性启动子包括ef1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、eef2启动子、泛素启动子、sv40启动子或hsvtk启动子，例如选自seqidno94-154的启动子。19.本发明的一个方面是修饰的人免疫细胞。此外，已经被修饰以增强其存活或增殖的动物免疫细胞作为实验模型和作为动物治疗剂也是有价值的。本发明的一个方面是来自包括灵长类、啮齿类、猫科动物、犬类和马类等哺乳动物的修饰的免疫细胞。附图说明20.图1.用爪蟾或家蚕piggybac样基因转移系统转染的jurkat人t细胞系的facs分析。如6.1.1节所述，用转座酶和包含cd19基因的相应转座子转染人jurkat细胞。70天后，使用facs分选仪选择表达cd19的细胞并在培养物中再生长85天。然后对细胞进行cd19染色并在facs上进行分析。图a：分析最初用如seqidno：223所示序列的转座子转染的细胞的cd19(y轴)和gfp(x轴)。图b：分析最初用如seqidno：224所示序列的转座子转染的细胞的cd19(y轴)和rfp(x轴)。21.图2.用编码突变stat3的基因转染的原代t细胞的facs分析。用转座酶和相应的转座子共转染人原代t细胞，该转座子包含编码stat3突变形式(stat3-y640f)的基因和编码绿色荧光蛋白(gfp)的基因。图a：将细胞培养不同的时间(在顶部显示)，之后取样，用荧光标记的抗cd8抗体标记，并使用荧光激活细胞分选仪分析。在t细胞表面上表达的cd8显示在y轴上，gfp(其指示了包含stat3y640f基因的转座子的存在)显示在x轴上。图b：由图a中显示的数据计算显示gfp荧光的cd8+细胞分数(fraction)。22.图3.转染的原代t细胞和来自jyb细胞系的细胞的混合物的facs分析。如6.2.1.3节中所述，用转座酶和3个相应转座子其中之一共转染人原代t细胞，该转座子包含编码序列如seqidno：229所示的嵌合抗原受体的基因和gfp报告基因。一个转座子不包含其他基因(图a和d)，一个转座子还包含编码生存素的基因(图b和e)，以及一个转座子还包含编码cd28-d124e-t195p的基因(图c和f)。将细胞培养约5周，此时约10％的t细胞表达gfp。此时将200,000个t细胞(＝20,000个表达gfp的t细胞)与200,000个jy转化的b细胞系混合。混合后3天(图a、c和e)或7天(图b、d和f)后，用荧光标记的抗cd8和抗cd19抗体标记细胞，并使用荧光激活细胞分选仪进行分析。在t细胞表面上表达的cd8显示在y轴上，在jy细胞表面上表达的cd19显示在x轴上。23.图4.用编码bcl-2和bcl-6的基因转染的原代t细胞的facs分析。用转座酶和相应的转座子共转染人原代t细胞，该转座子包含编码bcl2和bbcl6的基因和编码绿色荧光蛋白(gfp)的基因。图a：将细胞培养不同的时间(在顶部显示)，之后取样，用荧光标记的抗cd8抗体标记，并使用荧光激活细胞分选仪分析。在t细胞表面上表达的cd8显示在y轴上，gfp(其指示了包含bcl2-2a-bcl6基因的转座子的存在)显示在x轴上。图b：由图a中显示的数据计算显示gfp荧光的cd8+细胞分数。24.图5.来自用编码bcl-xl的基因转染的3个供体的原代t细胞的facs分析。用转座酶和相应的转座子共转染人原代t细胞，该转座子包含编码bcl-xl的基因和编码绿色荧光蛋白(gfp)的基因。细胞在培养物中生长240天，用抗人cd8的荧光标记抗体染色并在流式细胞仪上分析。图a：供体81；图a：供体82；图a：供体84。在t细胞表面上表达的cd8显示在y轴上，gfp(其指示包含bcl-xl基因的转座子的存在)显示在x轴上。具体实施方式25.5.1定义26.除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一种(a、an)”和“该(the)”的使用包括复数指代。因此，例如，提及“多核苷酸(apolynucleotide)”包括多个多核苷酸，提及“底物(asubstrate)”包括多个这样的底物，提及“变体(avariant)”包括多个变体等。27.除非上下文另外明确指出，否则术语例如“连接的(connected)”、“附接的(attached)”、“连结的(linked)”和“缀合的(conjugated)”在本文中可互换使用，并且涵盖直接以及间接的连接、附接、连结或缀合。在列举数值范围的情况下，应当理解，也具体公开了在该范围的列举的上限和下限之间的每个中间整数值及其每个分数，以及在这些数值之间的每个子范围。任何范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或从该范围排除，并且包括任一、两个或两个极限的每个范围也包括在本发明内。当所讨论的值具有固有极限时，例如当组分可以0-100％的浓度存在时，或当水溶液的ph可以为1-14时，这些固有极限被具体公开。在明确列举数值的情况下，应当理解的是，与所列举的数值大约相同数量或量的值也在本发明的范围内。在公开组合的情况下，该组合的要素的每个子组合也被具体公开并且在本发明的范围内。相反，在单独公开不同的要素或要素组的情况下，也公开了其组合。在本发明的任何要素被公开为具有多个替代方案的情况下，还由此公开了本发明的实施例，其中每个替代方案单独地或以与其他替代方案的任何组合被排除；本发明的一个以上的要素可以具有这样的排除，并且具有这样的排除的要素的所有组合由此被公开。28.除非本文另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。singleton等人，dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology，2nded.(微生物学和分子生物学词典，第二版)，johnwileyandsons，newyork(约翰·威利父子出版公司，纽约)(1994)，以及hale&marham,theharpercollinsdictionaryofbiology，harperperennial(哈珀·柯林斯生物学词典)，ny，1991，为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的通用词典。尽管在本发明的实践或测试中可以使用与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料，但描述了优选的方法和材料。除非另有说明，核酸以5'至3'方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基的方向从左到右书写。下面紧接着定义的术语通过参考说明书整体而更全面地定义。29.多核苷酸的“构型(configuration)”是指多核苷酸内的功能序列元件、以及这些元件的顺序和方向。30.术语“相应的转座子(correspondingtransposon)”和“相应的转座酶(correspondingtransposase)”用于表示转座酶和转座子之间的活性关系。转座酶转座其相应的转座子。31.术语“反向可选择性标记(counter-selectablemarker)”是指赋予宿主细胞选择性缺点的多核苷酸序列。反向可选择性标记的实例包括sacb，rpsl、tetar、phes、thya、gata-1、ccdb、kid和barnase(bernard，1995，journal/gene，162：159-160；bernard等人，1994.journal/gene，148：71-74；gabant等人,1997，journal/biotechniques，23：938-941；gababt等人,1998，journal/gene，207：87-92；gababt等人,2000，journal/biotechniques，28：784-788；galvao和delorenzo，2005，journal/applenvironmicrobiol，71：883-892；hartzog等人,2005，journal/yeat，22:789-798；knipfer等人,1997，journal/plasmid，37：129-140；reyrat等人,1998，journal/infectimmun，66：4011-4017；soderholm等人,2001，journal/biotechniques，31：306-310，312；tamura等人,2005，journal/applenvironmicrobiol，71：587-590；yazynin等人,1999，journal/febslett，452：351-354)。反向可选择性标记通常在特定背景中赋予它们选择性的缺点。例如，它们可以赋予对可以加入宿主细胞环境中的化合物的敏感性，或者它们可以杀伤具有一种基因型的宿主但不杀伤具有不同基因型的宿主。不赋予携带反向可选择性标记的细胞选择性缺点的条件被描述为“允许的(permissive)”。确实赋予携带反向可选择性标记的细胞选择性缺点的条件被描述为“限制性的(restrictive)”。32.术语“偶联元件(couplingelement)”或“翻译偶联元件(ranslationalcouplingelement)”是指允许第一多肽的表达与第二多肽的表达连接的dna序列。内部核糖体进入位点元件(ires元件)和顺式作用水解酶元件(chysel元件)是偶联元件的实例。33.术语“dna序列”、“rna序列”或“多核苷酸序列”是指连续的核酸序列。该序列可以是长度为2至20个核苷酸的寡核苷酸至数千或数十万碱基对的全长基因组序列。34.术语“增强型信号传导受体(enhancedsignalingreceptor)”(或“esr”)是指其中向免疫细胞传递抑制信号的受体的胞外/配体结合结构域与传递刺激信号的受体的胞内结构域融合的蛋白质。35.术语“表达构建体(expressionconstruct)”是指设计用于转录rna的任何多核苷酸。例如，包含至少一个启动子(与或可能与下游基因可操作地连接)、编码区或多核苷酸序列的构建体(例如，编码多肽或蛋白质的cdna或基因组dna片段；或rna效应分子，例如反义rna、形成三链体的rna、核酶、人工选择的高亲和力rna配体(适配体)、双链rna，例如包含茎-环或发夹dsrna的rna分子、或双指或多指dsrna或微小rna、或任何rna)。“表达载体(expressionvector)”是包含可与第二多核苷酸可操作地连接的启动子的多核苷酸。将表达构建体转染或转化到受体细胞中使得细胞表达由表达构建体编码的rna效应分子、多肽或蛋白质。表达构建体可以是经基因工程改造的质粒、病毒、重组病毒或衍生自例如噬菌体、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、痘病毒或疱疹病毒的人工染色体。这样的表达载体可以包括来自细菌、病毒或噬菌体的序列。这类载体包括染色体、附加体(episomal)和病毒衍生的载体，例如，衍生自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件和病毒的载体，以及衍生自其组合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件、粘粒和噬菌粒的载体。表达构建体可在活细胞中复制或可合成制备。出于本技术的目的，术语“表达构建体”、“表达载体”、“载体”和“质粒”可互换使用，以在一般的说明性意义上展示本发明的应用，并且不旨在将本发明限于特定类型的表达构建体。36.术语“表达多肽(expressionpolypeptide)”是指由表达构建体上的基因编码的多肽。37.术语“表达系统(expressionsystem)”是指用于产生由多核苷酸编码的一种或多种基因产物的任何体内或体外生物系统。[0038]“基因转移系统(genetransfersystem)”包括载体或基因转移载体、或包含克隆到载体中的待转移基因的多核苷酸(“基因转移多核苷酸”或“基因转移构建体”)。基因转移系统还可以包括其他特征以促进基因转移的过程。例如，基因转移系统可以包含载体和用于使第一多核苷酸进入细胞的脂质或病毒包装混合物，或者它可以包含包括转座子的多核苷酸和编码相应转座酶以增强转座子的生产性基因组整合的第二多核苷酸序列。基因转移系统的转座酶和转座子可以位于相同的核酸分子上或位于不同的核酸分子上。基因转移系统的转座酶可以作为多核苷酸或多肽提供。[0039]两个元件如果不是天然相关的，则彼此是“异源的”。例如，编码与异源启动子连接的蛋白的核酸序列是指不同于天然驱动蛋白质表达的启动子。侧翼为转座子末端或itr的异源核酸是指天然情况下侧翼不是那些转座子末端或itr的异源核酸，例如编码不同于转座酶的多肽的核酸，包括抗体重链或轻链。如果核酸不是天然存在于细胞，或者如果天然存在于细胞中但是位于与所述定位不同的定位(例如，附加体或不同的基因组定位)，则核酸对于细胞是异源的。[0040]术语“宿主”是指可以是核酸受体的任何原核或真核生物。本文所用术语“宿主”包括可进行基因工程改造的原核或真核生物。这些宿主的例子参见maniatis等人，molecularcloning.alaboratorymanual(分子克隆实验指南)，coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，n.y.(冷泉港实验室，冷泉港，纽约)(1982)。如本文所用，术语“宿主”、“宿主细胞”、“宿主系统”和“表达宿主”可互换使用。[0041]“ires”或“内部核糖体进入位点”是指独立于帽结构直接促进核糖体结合的特异性序列。[0042]“分离的(isolated)”多肽或多核苷酸是指已经从其天然环境中移除、使用重组技术产生或化学或酶促合成的多肽或多核苷酸。本发明的多肽或多核苷酸可以是纯化的，即基本上不含任何其他多肽或多核苷酸和相关的细胞产物或其他杂质。[0043]术语“核苷(nucleoside)”和“核苷酸(nucleotide)”包括不仅含有已知的嘌呤和嘧啶碱基，还含有其他经修饰的杂环碱基的那些部分。这些修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶或其他杂环。修饰的核苷或核苷酸还可以包括在糖部分上的修饰，例如，其中一个或多个羟基被卤素、脂肪族基团替代，或官能化为醚、胺等。术语“核苷酸单元(nucleotidicunit)”旨在涵盖核苷和核苷酸。[0044]“开放阅读框”或“orf”是指当被翻译成氨基酸时不含终止密码子的多核苷酸的一部分。遗传密码以3个碱基对组成的组读取dna序列，这意味着双链dna分子可以以6个可能的阅读框中的任何一个阅读—3个正向读框，3个反向读框。orf通常还包括起始密码子，翻译可在该起始密码子处开始。[0045]术语“可操作地连接”是指两个序列之间的功能性连接，使得一个序列修饰另一个序列的行为。例如，如果第一多核苷酸影响第二多核苷酸的转录和/或翻译，则包含核酸表达控制序列(例如启动子、ires序列、增强子或转录因子结合位点阵列)的第一多核苷酸与第二多核苷酸可操作地连接。类似地，如果第一氨基酸序列导致第二氨基酸序列被分泌或定位至亚细胞定位，则包含分泌信号或亚细胞定位信号的第一氨基酸序列与第二氨基酸序列可操作地连接。[0046]术语“突出端(overhang)”或“dna突出端(dnaoverhang)”是指双链dna分子末端的单链部分。互补突出端是彼此碱基配对的突出端。[0047]“piggybac样转座酶(piggybac-liketransposase)”是指使用tblastn算法鉴定的与来自粉纹夜蛾(trichoplusiani)的piggybac转座酶(seqidno：30)具有至少20％序列同一性的转座酶，更全面地描述于sakar，a.等人，(2003).mol.gen.genomics270：173-180.“molecularevolutionaryanalysisofthewidespreadpiggybactransposonfamilyandrelated'domesticated'species(广泛分布的piggybac转座子家族和相关的‘驯化’物种的分子进化分析)”，并且进一步的特征在于dde样ddd基序，在最大比对处在对应于粉纹夜蛾piggybac转座酶d268、d346和d447的位置具有天冬氨酸残基。piggybac样转座酶的特征还在于它们能够以高频率精确地切除它们的转座子。“piggybac样转座子(piggybac-liketransposon)”是指具有转座子末端的转座子，该转座子末端与编码piggybac样转座酶的天然存在的转座子的转座子末端相同或具有至少80％、优选至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。piggybac样转座子在每端包括约12-16个碱基的反向末端重复(itr)序列。这些重复在两端可以相同，或者在两端的重复在两个itr中的1或2或3或4个位置可以不同。转座子的两侧各有一个4碱基序列，对应于转座子整合中重复的整合靶序列(靶位点重复或靶序列重复或tsd)。[0048]术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”以及“基因”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，并且可以包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或其混合物。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“dna”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“rna”)。它还包括修饰的(例如通过烷基化、和/或通过加帽)和未修饰形式的多核苷酸。更具体地，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-d-核糖)、多核糖核苷酸(含有d-核糖)，包括trna、rrna、hrna、sirna和mrna，无论是剪接的还是未剪接的、以及任何其他类型的核酸，该核酸是嘌呤或嘧啶碱的n-或c-糖苷以及其他包含非核苷酸主链的聚合物，例如，聚酰胺(例如，核酸肽类(pna))以及聚吗啉代(可从俄勒冈州科瓦利斯市的anti-virals公司以neugene名称商购)聚合物以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，其条件是这些聚合物包含处于一种构型的核碱基，该构型允许碱基配对以及碱基堆积，例如在dna以及rna中发现的一样。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”之间在长度上没有有意的区别，并且这些术语在本文中可互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括例如3'-脱氧-2',5'dna、寡脱氧核糖核苷酸n3'p5'氨基磷酸酯、2'o-烷基取代的rna、双链和单链dna以及双链和单链rna及其杂交体，包括例如，dna和rna之间或pna和dna或rna之间的杂交体，还包括已知类型的修饰，例如标记、烷基化、“加帽”、用类似物取代一个或多个核苷酸、核苷酸内修饰，例如，那些具有不带电荷的键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)、带负电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)和带正电荷的键(例如，氨基烷基氨基磷酸酯、氨基烷基磷酸三酯)的修饰；那些含有悬垂部分(pendantmoieties)的修饰例如，蛋白质(包括酶(例如，核酸酶)、毒素、抗体、信号肽、聚l-赖氨酸等)；那些具有嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的修饰；那些含有(例如金属，放射性金属、硼、氧化金属等的)螯合物的修饰；那些含有烷化剂的修饰；那些具有修饰键(例如α端基异构核酸等)的修饰；以及未修饰形式的多核苷酸或寡核苷酸。[0049]“启动子”是指足以指导可操作地连接的核酸分子转录的核酸序列。启动子可与其他转录控制元件(例如增强子)一起使用，其他转录控制元件足以使启动子依赖性基因表达以细胞类型特异性、组织特异性或时间特异性方式可控，或可由外部信号或试剂诱导；这些元件可以位于基因的3'区内或内含子内。期望地，启动子可操作地连接到核酸序列，例如cdna或基因序列、或效应子rna编码序列，以使核酸序列能够表达的方式或者在表达盒中提供启动子，其中待转录的选定核酸序列可以方便地插入到表达盒中。[0050]术语“选择性标记(selectablemarker)”是指允许人们通常在特定条件下选择或针对含有它的分子或细胞的多核苷酸片段。这些标记可以编码活性，例如但不限于rna、肽或蛋白质的产生，或者可以提供rna、肽、蛋白质、无机和有机化合物或组合物的结合位点。选择性标记的实例包括但不限于：(1)编码对其他有毒化合物(例如抗生素)提供抗性的产物的dna片段；(2)编码受体细胞中缺乏的产物(例如trna基因、营养缺陷标记)的dna片段；(3)编码抑制基因产物活性的产物的dna片段；(4)编码易于鉴定的产物(例如，表型标记例如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(gfp)和细胞表面蛋白)的dna片段；(5)结合对细胞存活和/或功能有害的产物的dna片段；(6)抑制上述no.1-5中描述的任何dna片段(例如，反义寡核苷酸)活性的dna片段；(7)结合修饰底物的产物(例如限制性内切核酸酶)的dna片段；(8)可用于分离所需分子(例如特异性蛋白结合位点)的dna片段；(9)编码特异性核苷酸序列的dna片段，该核苷酸序列另外可以是非功能性的(例如，用于分子亚群的pcr扩增)；和/或(10)在不存在时直接或间接赋予对特定化合物敏感性的dna片段。[0051]序列同一性可以通过使用算法比对序列来确定，例如在wisconsingeneticssoftwarepackagerelease7.0，geneticscomputergroup，575sciencedr.，madison，wis.中使用默认缺口参数的bestfit、fasta和tfasta，或通过检查，以及最佳比对(即，在比较窗口中产生最高百分比的序列相似性)。序列同一性百分比通过比较比较窗口上的两个最佳比对序列、确定两个序列中相同残基出现的位置数以产生匹配位置数、将匹配位置数除以不计算比较窗口中的间隙的匹配和不匹配位置的总数(即窗口大小)、将结果乘以100以得到序列同一性百分比。除非另有说明，两个序列之间的比较窗口由两个序列中较短序列的全长限定。[0052]睡美人转座酶是一种mariner型转座酶，其序列与seqidno：28具有至少90％、95％、99％或100％同一性，能够将具有左端序列seqidno：24和右端序列seqidno：25的转座子转座到宿主细胞的基因组中。睡美人转座子包含与seqidno：26具有至少90％、95％、99％或100％同一性的左itr以及与seqidno：27具有90％同一性的右itr。睡美人转座子可以包含与seqidno：24具有至少90％、95％、99％或100％同一性的转座子末端(包括itr)以及与seqidno：25具有至少90％、95％、99％或100％同一性的右转座子末端(包括itr)，并且其可以通过如seqidno：28所示的睡美人转座酶转座到宿主细胞的基因组中。[0053]“靶核酸”是一种将转座子插入其中的核酸。这样的靶标可以是染色体、附加体或载体的一部分。[0054]转座酶的“整合靶序列”或“靶序列”或“靶位点”是靶dna分子中可以通过转座酶插入转座子的位点或序列。来自粉纹夜蛾(trichoplusiani)的piggybac转座酶将其转座子主要插入靶序列5'-ttaa-3’中。piggybac样转座酶使用剪切和粘贴机制将它们的转座子转座，这导致它们的4个碱基对靶序列在插入dna分子时复制。因此，靶序列存在于整合的piggybac样转座子的每一侧。[0055]术语“翻译”是指通过核糖体“读取”多核苷酸序列来合成多肽的过程。[0056]“转座酶”是一种多肽，其催化从供体多核苷酸(例如载体)中切除相应的转座子，并且(假设转座酶不是整合缺陷的)随后将转座子整合到靶核酸中。转座酶可以是piggybac样转座酶或mariner转座酶如睡美人。[0057]本文所用术语“转座”是指转座酶在从一个多核苷酸上切除转座子然后将其整合到同一多核苷酸的不同位点或第二多核苷酸中的作用。[0058]术语“转座子”是指可通过相应的反式作用转座酶的作用从第一多核苷酸(例如，载体)切除并整合到同一多核苷酸中的第二位置或第二多核苷酸(例如，细胞的基因组或染色体外dna)中的多核苷酸。转座子包含第一转座子末端和第二转座子末端，它们是由转座酶识别和转座的多核苷酸序列。转座子通常还包含位于两个转座子末端之间的第一多核苷酸序列，使得第一多核苷酸序列在转座酶的作用下与两个转座子末端一起转座。天然转座子通常包含编码作用于转座子的转座酶的dna。本发明的转座子是包含异源多核苷酸序列的“合成转座子”，该序列凭借其在两个转座子末端之间的并置而可转座。转座子可以是piggybac样转座子或marine转座子如睡美人。[0059]术语“转座子末端”是指足以被相应转座酶识别和转座的顺式作用核苷酸序列。piggybac样转座子的转座子末端包含完美或不完美的重复，使得两个转座子末端中的相应重复是彼此的反向互补。这些称为反向末端重复(itr)或末端反向重复(tir)。转座子末端可以包括或不包括邻近itr的促进或增强转座的额外序列。[0060]术语“载体”或“dna载体”或“基因转移载体”是指用于对另一多核苷酸执行“携带”功能的多核苷酸。例如，通常使用载体以允许多核苷酸在活细胞内增殖、或允许多核苷酸被包装以递送到细胞中、或允许多核苷酸整合到细胞的基因组dna中。载体还可以包含另外的功能元件，例如它可以包含转座子。[0061]免疫细胞可以指免疫系统的任何细胞，包括适应性和先天免疫系统的细胞，并且包括骨髓或淋巴来源的细胞。免疫细胞的实例包括白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、淋巴样细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和天然杀伤细胞。淋巴细胞包括b淋巴细胞和t淋巴细胞。t淋巴细胞包括杀伤t细胞、辅助t细胞和γδt细胞。免疫细胞可以是从受试者分离的原代细胞，或者可以是进一步培养的结果，包括以细胞系的形式。除了本文所述的之外，免疫细胞可以是基因工程的受试者，例如cart受体的表达。[0062]本公开涉及几种蛋白质，其提供了代表该蛋白质的野生型人序列的示例性seqidno.。除非从上下文中另有说明，否则提及蛋白质应理解为包括所例示的seqidno.以及与其具有至少90％、95％或99％同一性的其等位基因变体、物种变体和诱导变体。等位基因和物种变体的实例可以在swissprot和其他数据库中找到。可以修饰蛋白质的任何此类序列以包括本文所述的一个或多个激活突变，以赋予表达如本文进一步所述的蛋白质的免疫细胞增强的存活。[0063]有时以xny的形式提及突变，其中x为野生型氨基酸，n为野生型序列中x的氨基酸位置，并且y为置换氨基酸。如果突变发生在与野生型序列具有不同数目氨基酸的序列中，则当各序列最大比对时，它存在于序列中与野生型序列中位置n比对的位置处。[0064]如果核酸被认为编码特定蛋白的激活突变体，则意味着核酸编码包括激活突变的蛋白。[0065]凋亡抑制因子(apoptosisinhibitor)是一种干扰程序性细胞死亡(凋亡)过程的物质。细胞凋亡是高度调控的过程，其中细胞死亡是通过激活细胞内半胱天冬酶蛋白酶诱导的。凋亡抑制因子包括其天然功能是对抗细胞凋亡的蛋白，以及其天然功能是参与细胞凋亡但包含干扰细胞凋亡的突变的蛋白。[0066]凋亡测定法检测和定量与程序性细胞死亡相关的细胞事件，包括半胱天冬酶(caspase)激活、磷脂酰丝氨酸(ps)的细胞表面暴露和dna断裂。起始子和效应子半胱天冬酶是检测细胞凋亡的特别好的靶标。半胱天冬酶活性测定使用由天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶裂解的肽底物，或结合到活细胞中的激活的半胱天冬酶的类似底物(mcstay等人，2014coldspringharborprotocols，measuringapoptosis：caspaseinhibitorsandactivityassays(2014冷泉港协议，测量细胞凋亡：半胱天冬酶抑制因子和活性测定)；niles等人，2008，methodsmolbiol.,414:137-50)。测量细胞凋亡抑制的示例性测定是使用本文第[00174]段中描述的荧光素酶的生物发光测定许多使用荧光或发光读数的半胱天冬酶测定试剂盒是可商购的，例如来自promega的caspase-测定使用发光的半胱天冬酶-8四肽底物(z-letd-氨基荧光素)、半胱天冬酶-9四肽底物(z-lehd-氨基荧光素)、半胱天冬酶-3/7底物(z-devd-氨基荧光素)、半胱天冬酶-6底物(z-veid-氨基荧光素)或半胱天冬酶-2底物(z-vdvad-氨基荧光素)以及在专用缓冲液中稳定的荧光素酶。在缺乏活性半胱天冬酶或半胱天冬酶抑制的情况下，半胱天冬酶底物不作为荧光素酶的底物，因此不产生光。在底物被各自的胱天蛋白酶裂解时，氨基荧光素被释放并可在发光反应中有助于光的产生。产生的发光信号与样品中存在的半胱天冬酶活性的量成正比。使用荧光底物n-乙酰asp-glu-val-asp-7-氨基-4-甲基香豆素或ac-devdamc检测半胱天冬酶-3的半胱天冬酶活性测定试剂盒的实例是来自cellsignalingtechnology(cst)的半胱天冬酶-3活性测定试剂盒。激活的半胱天冬酶-3在devd和amc之间切割这种底物，产生高荧光amc，可以使用荧光读取器检测到，激发波长为380nm，发射波长为420-460nm。底物的裂解仅发生在凋亡细胞的裂解物中；因此，产生的amc的量与样品中凋亡细胞的数量成比例。[0067]5.2用于在免疫细胞中表达的遗传元件[0068]5.2.1转座子元件[0069]如果异源多核苷酸整合到宿主细胞的基因组中，则可以提高免疫细胞中异源多核苷酸基因表达的一致性通过使多核苷酸经历确保基因组dna复制和分裂的相同机制，将多核苷酸整合到宿主细胞的基因组中通常也使其可稳定遗传。这种稳定的遗传性对于在长的生长周期内获得良好和一致的表达是理想的。对于免疫细胞的稳定修饰，特别是对于治疗应用，修饰的稳定性和表达水平的一致性是很重要的。[0070]如果异源多核苷酸是转座子的一部分，则它们可以更有效地整合到靶基因组中，例如使得它们可以通过转座酶整合。转座子的特别益处是转座子itr之间的完整多核苷酸被整合。这与随机整合相反，在随机整合中，导入真核细胞的多核苷酸通常在细胞中随机片段化，并且只有部分多核苷酸通常以低频率并入靶基因组。掺入piggybac样转座子的异源多核苷酸可以整合到免疫细胞，以及肝细胞、神经细胞、肌细胞、血细胞、胚胎干细胞、体干细胞、造血细胞、胚胎、受精卵和精子细胞(其中一些是开放的以在体外环境中操作)中。优选的细胞还可以是多能细胞(其后代可以分化成几种限制性细胞类型的细胞，例如造血干细胞或其他干细胞)或全能细胞(即，其后代可以变成生物体中的任何细胞类型的细胞，例如胚胎干细胞)。[0071]优选的基因转移系统包括与使转座子转座的相应转座酶蛋白或编码相应转座酶蛋白并可在靶细胞中表达的核酸组合的转座子。由于几个原因，与慢病毒载体相比，piggybac样转座子作为用于本文所述应用的基因转移系统是有利的。如果慢病毒超过一定大小，则不能有效地被包装，并且它们的大量的dna已经被病毒合成、装配和包装所需的序列占据。由于启动子沉默，通过慢病毒载体整合的基因可显示高度可变的表达(antoniou等人，2013.humgenether24，363-374.“optimizingretroviralgeneexpressionforeffectivetherapies(优化逆转录病毒基因表达以用于有效治疗)”)：可以通过增加拷贝数或通过将绝缘子掺入整合多核苷酸来降低沉默(emery，2011.humgenether22，761-774.“theuseofchromatininsulatorstoimprovetheexpressionandsafetyofintegratinggenetransfervectors(使用染色质绝缘子提高整合基因转移载体的表达和安全性)”)。由于大小限制以及由于包括这些序列对病毒包装和滴度的影响，在慢病毒构建体中包括绝缘子可能具有挑战性。相比之下，piggybac样转座子通过其相应的转座酶有效整合到靶基因组中不受增加转座子大小的影响。因此，可以将多个用于修饰免疫细胞性质的基因与侧翼绝缘子一起整合到单个转座子中，而不会损害相应转座酶将转座子整合到免疫细胞基因组中的能力。当修饰待置于人体内的细胞的基因组时，安全性也是重要的考虑因素。当对免疫细胞如t细胞进行修饰以增强其杀伤肿瘤细胞的能力并改善其存活和增殖的能力时，因此能够将提供杀伤经修饰的免疫细胞的方法的基因也掺入细胞的基因组中是有用的。这种“杀伤开关(killswitch)”的实例包括由现有治疗剂有效识别的抗原的表达(例如表面表达的抗原，如通常仅在b细胞上发现并且由药物利妥昔单抗识别和治疗的cd20，或通常仅在b细胞上发现并且由药物blinoumomab识别和治疗的cd19)和诱导型半胱天冬酶9自杀开关(straathof等人，2005.blood105，4247-4254.“用于t细胞疗法的诱导型半胱天冬酶9安全开关”)。为了使杀伤开关有用，它们必须存在于每个修饰细胞的基因组中。在携带嵌合抗原受体基因和编码cd19选择性标记的序列以及作为杀伤开关的诱导型半胱天冬酶9的慢病毒载体中进行这种尝试的实例描述于budde等人(plosone8(12)：e82742.doi：10.1371/journal.pone.0082742.ecollection2013.“组合cd20嵌合抗原受体和诱导型半胱天冬酶9自杀开关以改善t细胞过继性免疫治疗淋巴瘤的功效和安全性”)。为了将杀伤开关与嵌合抗原受体基因组合，作者必须使用病毒chysl/2a序列将包含嵌合抗原受体的多肽与诱导型半胱天冬酶9分离，并且它们必须截短cd19基因。该货物(cargo)和用于表达的调控元件基本上占据了慢病毒载体的全部容量，没有留下用于添加绝缘子或用于其他基因(例如用于增强t细胞的存活或增殖或功能的那些基因)的额外空间。因此，包含piggybac样转座子及其相应转座酶的基因转移系统有利于将包括编码嵌合抗原受体的基因在内的基因整合到包括t细胞在内的免疫细胞的基因组中。[0072]爪蟾转座子是用于修饰免疫细胞基因组的有利的piggybac样转座子，并且包含如seqidno：6所示序列的itr、待转座的异源多核苷酸和如seqidno：7所示序列的第二个itr。转座子的每一侧侧翼还可以为四核苷酸5'-ttaa-3'的拷贝，紧邻itr并远离异源多核苷酸。转座子还可以包含紧邻itr并邻近异源多核苷酸的序列，其在异源多核苷酸的一侧(优选左侧)与seqidno：1或2具有至少95％同一性；以及紧邻itr并邻近异源多核苷酸的序列，其在异源多核苷酸的另一侧(优选右侧)与seqidno：4或5具有至少95％同一性。该转座子可以通过转座酶进行转座，该转座酶包含与seqid：31或32的序列具有至少90％同一性的序列，例如seqidno：33-63中的任一个。优选该转座酶是天然转座酶的高度变异体。优选地，该超活性变体转座酶相对于seqidno：31的序列包含以下氨基酸改变之一：y6l、y6h、y6v、y6i、y6c、y6g、y6a、y6s、y6f、y6r、y6p、y6d、y6n、s7g、s7v、s7d、e9w、e9d、e9e、m16e、m16n、m16d、m16s、m16q、m16t、m16a、m16l、m16h、m16f、m16i、s18c、s18y、s18m、s18l、s18q、s18g、s18p、s18a、s18w、s18h、s18k、s18i、s18v、s19c、s19v、s19l、s19f、s19k、s19e、s19d、s19g、s19n、s19a、s19m、s19p、s19y、s19r、s19t、s19q、s20g、s20m、s20l、s20v、s20h、s20w、s20a、s20c、s20q、s20d、s20f、s20n、s20r、e21n、e21w、e21g、e21q、e21l、e21d、e21a、e21p、e21t、e21s、e21y、e21v、e21f、e21m、e22c、e22h、e22r、e22l、e22k、e22s、e22g、e22m、e22v、e22q、e22a、e22y、e22w、e22d、e22t、f23q、f23a、f23d、f23w、f23k、f23t、f23v、f23m、f23n、f23p、f23h、f23e、f23c、f23r、f23y、s24l、s24w、s24h、s24v、s24p、s24i、s24f、s24k、s24y、s24d、s24c、s24n、s24g、s24a、s26f、s26h、s26v、s26q、s26y、s26w、s28k、s28y、s28c、s28m、s28l、s28h、s28t、s28q、v31l、v31t、v31i、v31q、v31k、a34l、a34e、l67a、l67t、l67m、l67v、l67c、l67h、l67e、l67y、g73h、g73n、g73k、g73f、g73v、g73d、g73s、g73w、g73l、a76l、a76r、a76e、a76i、a76v、d77n、d77q、d77y、d77l、d77t、p88a、p88e、p88n、p88h、p88d、p88l、n91d、n91r、n91a、n91l、n91h、n91v、y141i、y141m、y141q、y141s、y141e、y141w、y141v、y141f、y141a、y141c、y141k、y141l、y141h、y141r、n145c、n145m、n145a、n145q、n145i、n145f、n145g、n145d、n145e、n145v、n145h、n145w、n145y、n145l、n145r、n145s、p146v、p146t、p146w、p146c、p146q、p146l、p146y、p146k、p146n、p146f、p146e、p148m、p148r、p148v、p148f、p148t、p148c、p148q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9n、s409i、s409d、s409f、s409t、s409c、s409q、n441f、n441r、n441m、n441g、n441c、n441d、n441l、n441a、n441v、n441w、g448w、g448y、g448h、g448c、g448t、g448v、g448n、g448q、e449a、e449p、e449t、e449l、e449h、e449g、e449c、e449i、v469t、v469a、v469h、v469c、v469l、l472k、l472q、l472m、c473g、c473q、c473t、c473i、c473m、r484h、r484k、t507r、t507d、t507s、t507g、t507k、t507i、t507m、t507e、t507c、t507l、t507v、g523q、g523t、g523a、g523m、g523s、g523c、g523i、g523l、i527m、i527v、y528n、y528w、y528m、y528q、y528k、y528v、y528i、y528g、y528d、y528a、y528e、y528r、y543c、y543w、y543i、y543m、y543q、y543a、y543r、y543h、e549k、e549c、e549i、e549q、e549a、e549h、e549c、e549m、e549s、e549f、e549l、k550r、k550m、k550q、s556g、s556v、s556i、p557w、p557t、p557s、p557a、p557q、p557k、p557d、p557g、p557n、p557l、p557v、h559k、h559s、h559c、h559i、h559w、v560f、v560p、v560i、v560h、v560y、v560k、n561p、n561q、n561g、n561a、v562y、v562i、v562s、v562m、v567i、v567h、v567n、s583m、e601v、e601f、e601q、e601w、e605r、e605w、e605k、e605m、e605p、e605y、e605c、e605h、e605a、e605q、e605s、e605v、e605i、e605g、d607v、d607y、d607c、d607n、d607w、d607t、d607a、d607h、d607q、d607e、d607l、d607k、d607g、s609r、s609w、s609h、s609v、s609q、s609g、s609t、s609k、s609n、s609y、l610t、l610i、l610k、l610g、l610a、l610w、l610d、l610q、l610s、l610f或l610n。[0074]piggybat转座子是用于修饰免疫细胞基因组的有利的piggybac样转座子，并且包含如seqidno：20所示序列的itr、待转座的异源多核苷酸和如seqidno：21所示序列的第二个itr。转座子的每一侧侧翼还可以为四核苷酸5'-ttaa-3'的拷贝，紧邻itr并远离异源多核苷酸。转座子还可以包含紧邻itr并邻近异源多核苷酸的序列，其在异源多核苷酸的一侧(优选左侧)与seqidno：22具有至少95％同一性；以及紧邻itr并邻近异源多核苷酸的序列，其在异源多核苷酸的另一侧(优选右侧)与seqidno：23具有至少95％同一性。该转座子可以通过转座酶进行转座，该转座酶包含与seqidno：29具有至少90％同一性的序列。优选该转座酶是天然转座酶的高度变异体。优选地，该超活性变体转座酶相对于seqidno：29的序列包含以下氨基酸改变之一：a14v、d475g、p491q、a561t、t546t、t300a、t294a、a520t、g239s、s5p、s8f、s54n、d9n、d9g、1345v、m481v、eilg、k130t、g9g、r427h、s8p、s36g、dlog、s36g。[0075]用于修饰免疫细胞基因组的有利的piggybac样转座子包含如seqidno：16所示序列的itr、待转座的异源多核苷酸和如seqidno：17所示序列的第二itr。转座子的每一侧侧翼还可以为四核苷酸5'-ttaa-3'的拷贝，紧邻itr并远离异源多核苷酸。转座子还可以包含紧邻itr并邻近异源多核苷酸的序列，其在异源多核苷酸的一侧(优选左侧)与seqidno：18具有至少95％同一性；以及紧邻itr并邻近异源多核苷酸的序列，其在异源多核苷酸的另一侧(优选右侧)与seqidno：19具有至少95％同一性。该转座子可以通过转座酶进行转座，该转座酶包含与seqidno：30具有至少90％同一性的序列。优选该转座酶是天然转座酶的高度变异体。优选地，该超活性变体转座酶相对于seqidno：30的序列包含以下氨基酸改变之一：g2c、q40r、i30v、g165s、t43a、s61r、s103p、s103t、m194v、r281g、m282v、g316e、i426v、q497l、n505d、q573l、s509g、n570s、n538k、q591p、q591r、f594l、m194v、i30v、s103p、g165s、m282v、s509g、n538k、n571s、c41t、a1424g、c1472a、g1681a、t150c、a351g、a279g、t1638c、a898g、a880g、g1558a、a687g、g715a、t13c、c23t、g161a、g25a、t1050c、a1356g、a26g、a1033g、a1441g、a32g、a389c、a32g、a389c、a32g、t1572a、g456a、t1641c、tl155c、g1280a、t22c、a106g、a29g、c137t、a14v、d475g、p491q、a561t、t546t、t300a、t294a、a520t、g239s、s5p、s8f、s54n、d9n、d9g、1345v、m481v、e1lg、k130t、g9g、r427h、s8p、s36g、dl0g、s36g、a51t、c153a、c277t、g201a、g202a、t236a、a103t、a104c、t140c、g138t、t118a、c74t、a179c、s3n、i30v、a46s、a46t、i82w、s103p、r119p、c125a、c125l、g165s、y177k、y177h、f180l、f180i、f180v、m185l、a187g、f200w、v207p、v209f、m226f、l235r、v240k、f241l、p243k、n258s、m282q、l296w、l296y、l296f、m298v、m298a、m298l、p311v、p311i、r315k、t319g、y327r、y328v、c340g、c340l、d421h、v436i、m456y、l470f、s486k、m503i、m503l、v552k、a570t、q591p、q591r、r65a、r65e、r95a、r95e、r97a、r97e、r135a、r135e、r161a、r161e、r192a、r192e、r208a、r208e、k176a、k176e、k195a、k195e、s171e、m14v、d270n、i30v、g165s、m282l、m282i、m282v或m282a。[0076]用于修饰免疫细胞基因组的有利的mariner转座子是睡美人转座子，其包含如seqidno：26所示序列的itr、异源多核苷酸和如seqidno：27所示序列的第二itr。itr可以是较长转座子末端序列的一部分，例如转座子可以包含与seqidno：24具有至少95％同一性的序列的左端和与seqidno：25具有至少95％同一性的序列的右端。转座子可以被转座酶转座，该转座酶包含与seqidno：28具有至少90％同一性的序列，包括其超活性变体。[0077]用于修饰免疫细胞基因组的有利的hat转座子为tcbuster转座子，其包含如seqidno：399所示序列的itr、异源多核苷酸和如seqidno：400所示序列的第二itr。itr可以是较长转座子末端序列的一部分，例如转座子可以包含与seqidno：397具有至少95％同一性的序列的左端和与seqidno：398具有至少95％同一性的序列的右端。转座子可以被转座酶转座，该转座酶包含与seqidno：401具有至少90％同一性的序列，包括其超活性变体。[0078]转座酶蛋白可以作为蛋白或作为编码转座酶的核酸，例如，作为核糖核酸，包括mrna或由细胞的翻译机器识别的任何多核苷酸；作为dna，例如作为染色体外dna，包括附加体dna；作为质粒dna或作为病毒核酸导入细胞。此外，编码转座酶蛋白的核酸可以作为核酸载体(例如质粒)或作为基因表达载体(包括病毒载体)转染到细胞中。核酸可以是环状的或线性的。编码转座酶蛋白的dna可以稳定地插入细胞的基因组或用于组成型或诱导型表达的载体中。当转座酶蛋白转染入细胞或作为dna插入载体时，转座酶编码序列优选与异源启动子可操作地连接。存在多种可使用的启动子，包括组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子等。编码piggybac样转座酶蛋白的所有dna或rna序列都是明确考虑的。或者，例如，可以使用细胞穿透肽(例如，如ramsey和flynn(2015)pharmacol.ther.15:78-86“cell-penetratingpeptidestransporttherapeuticsintocells(细胞穿透肽将治疗剂转运到细胞中)”中所述)；使用小分子，包括盐和丙基甜菜碱(例如，如astolfo等人(2015)cell161：674-690中所述)；或电穿孔(例如，如morgan和day(1995)methodsinmolecularbiology48:63-71“通过电穿孔将蛋白质导入哺乳动物细胞中”中所述)将转座酶作为蛋白直接导入细胞中。[0079]5.2.2基因转移系统[0080]基因转移系统包含待转移至宿主细胞的多核苷酸。基因转移系统可以包含本文所述的任何转座子或转座酶，或者它可以包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸具有促进有效基因转移而不需要转座酶或转座子的其他特征。[0081]当存在基因转移系统的多个组分时，例如包含用于在靶细胞中表达的基因并且任选地包含转座子末端的一种或多种多核苷酸，以及转座酶(其可以作为蛋白质提供或由核酸编码)，这些组分可以同时或在不同时间转染到细胞中。例如，可以在转染相应的转座子之前、同时或之后，将转座酶蛋白或其编码核酸转染到细胞中。另外，基因转移系统的任一组分的施用可重复进行，例如，通过施用至少两个剂量的这种组分。[0082]转座酶蛋白可以由包括rna或dna的多核苷酸编码。如果转座酶以dna编码的基因形式提供，则其应当优选与在靶细胞中有活性的启动子可操作地连接。优选的rna分子包括具有适当取代以降低对细胞的毒性作用的那些，例如用假尿苷取代尿苷和用5-甲基胞嘧啶取代胞嘧啶。类似地，可以将转座子或编码本发明转座酶的核酸作为线性片段或作为环化片段、作为质粒或作为重组病毒dna转染到细胞中。[0083]通过诸如粒子轰击、电穿孔、显微注射等技术、将组分与脂质纳米颗粒或含脂质囊泡如阳离子脂质囊泡、dna缩合试剂(例如，磷酸钙、聚赖氨酸或聚乙烯亚胺)、或将其组分(即核酸)插入病毒载体并使病毒载体与细胞接触，可以将所述基因转移系统的组分转染到一个或多个细胞中。当使用病毒载体时，病毒载体可以包括本领域已知的多种病毒载体中的任何一种，包括选自逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体的病毒载体。基因转移系统可以以本领域已知的合适方式配制、或配制为药物组合物或试剂盒。[0084]5.2.3启动子元件[0085]用于在免疫细胞中表达多肽的基因转移系统包含待转移至宿主细胞的多核苷酸。多核苷酸包含在免疫细胞中有活性的启动子。实例包括来自组成型表达基因的启动子，该组成型表达基因包括哺乳动物甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因(例如seqidno：97-107的序列)、哺乳动物磷酸甘油酸激酶(pgk)基因(例如seqidno：115-118的序列)、哺乳动物延伸因子1a(ef1a)基因(例如seqidno：94、96和128-146的序列)、哺乳动物延伸因子2(eef2)基因(例如seqidno：1108、109、114和147-154的序列)和泛素基因(例如seqidno：95或125-127的序列)。这些基因可以与或不与内含子序列(包括它们的天然内含子序列)一起使用。示例性内含子序列如seqidno：155-159所示。[0086]5.2.4聚腺苷酸化元件[0087]基因转移系统可用于将用于表达的基因导入真核细胞。许多真核细胞，包括动物细胞和高等植物细胞，加工基因表达过程中转录的mrna。编码蛋白质的基因通常是多腺苷酸化的，其稳定细胞内的mrna。聚腺苷酸化信号也可以帮助终止转录。当要从多核苷酸表达一个以上的开放阅读框时，这可能特别有用，因为它有助于减少两个启动子之间的干扰。可以合成设计聚腺苷酸化序列，其有效终止从一个启动子的转录，从而减少对位于第一启动子3'的第二启动子的干扰。序列seqidno：160-217都可用于起始转录序列的聚腺苷酸化和终止转录。聚腺苷酸化序列seqidno：160-217可包括在用于在包括脊椎动物或无脊椎动物细胞的动物细胞中表达基因的基因转移系统的多核苷酸中。聚腺苷酸化序列seqidno：160-217可用于在脊椎动物细胞中表达基因，脊椎动物细胞包括来自哺乳动物的细胞，哺乳动物包括啮齿动物如大鼠、小鼠和仓鼠；有蹄类动物如牛、山羊或绵羊；猪；以及来自人组织和人干细胞的细胞。聚腺苷酸化序列seqidno：160-217可用于不同的细胞类型，包括免疫细胞、淋巴细胞、肝细胞、神经细胞、肌细胞、血细胞、胚胎干细胞、体干细胞、造血细胞、胚胎、受精卵和精子细胞(其中一些是开放的以在体外环境中操作)中。聚腺苷酸化序列seqidno：160-217可用于在多能细胞(其后代可分化成几种限制性细胞类型的细胞，例如造血干细胞或其他干细胞)或全能细胞(即，其后代可变成生物体中任何细胞类型的细胞，例如胚胎干细胞)中表达基因。聚腺苷酸化序列seqidno：160-217可用于在培养细胞如中国仓鼠卵巢(cho)细胞或人胚肾(hek293)细胞中表达基因。[0088]可以将seqidno：160-217的聚腺苷酸化序列掺入piggybac样转座子、或mariner转座子如睡美人转座子、或hat转座子如tcbuster、或基于非转座子的基因递送多核苷酸中。优选将聚腺苷酸化序列seqidno：160-217掺入多核苷酸中待表达的开放阅读框的3'端。当置于待表达的两个基因之间时，聚腺苷酸化序列seqidno：160-217可用于终止来自第一个启动子的转录并减少启动子干扰。有利的基因转移系统包含与seqidno：160-217的任一个具有至少80％或90％或95％或96％或97％或98％或99％或100％同一性的序列。[0089]5.2.5绝缘子元件[0090]当异源多核苷酸整合到免疫细胞的基因组中时，通常需要防止异源多核苷酸内的遗传元件影响内源免疫细胞基因的表达。类似地，通常需要防止异源多核苷酸内的基因受免疫细胞基因组中的元件影响，例如通过掺入异染色质中而沉默。已知绝缘子元件具有增强子阻断活性(有助于防止异源多核苷酸中的基因影响内源免疫细胞基因的表达)和屏障活性(有助于防止异源多核苷酸中的基因通过掺入异染色质而沉默)。增强子阻断活性可由转录抑制子ctcf蛋白的结合产生。屏障活性可由脊椎动物屏障蛋白如usf1和vezf1的结合产生。有用的绝缘子序列包含ctcf、usf1或vezf1的结合位点。有利的基因转移系统包含含有绝缘子序列的多核苷酸，绝缘子序列包含ctcf、usf1或vezf1的结合位点。更优选地，基因转移系统包含含有两个绝缘子序列的多核苷酸，每个绝缘子序列包含ctcf、usf1或vezf1的结合位点，其中两个绝缘子序列位于异源多核苷酸内的任何启动子或增强子的侧翼。绝缘子序列的有利实例如seqidno：87-93所示。[0091]如果将包含启动子或增强子的异源多核苷酸整合到没有绝缘子序列的免疫细胞的基因组中，则存在异源多核苷酸内的启动子或增强子元件将影响内源免疫细胞基因(例如癌基因)的表达、或者异源多核苷酸内的启动子或增强子元件将通过掺入异染色质中而沉默的风险。当异源多核苷酸在随机片段化之后整合到靶基因组中时，一些遗传元件经常丢失，而其他遗传元件可以重排。因此，存在显著的风险：如果异源多核苷酸包含侧翼为增强子和启动子元件的绝缘子元件，则绝缘子元件可能重排或丢失，并且增强子和启动子元件可能能够影响它们所整合的基因组环境并受其影响。因此，使用转座子基因转移系统是有利的，其中两个转座子itr之间的完整序列被整合到免疫细胞基因组中，而没有重排。因此，用于整合到免疫细胞基因组中的有利的基因转移系统包括转座子，其中元件按以下顺序排列：左转座子末端；第一绝缘子序列；用于在免疫细胞内表达的序列；第二绝缘子序列；右转座子末端。用于在免疫细胞内表达的序列可以包括与任何数量的开放阅读框有效连接的任何数量的调控序列。转座子末端优选是piggybac样转座子或mariner转座子如睡美人转座子、或hat转座子如tcbuster转座子的末端。[0092]5.3用于增强免疫细胞存活的遗传元件[0093]为了使免疫细胞充分应答对身体的威胁，它们必须能够存活足够长的时间以攻击它们的靶标。对于需要离体操作免疫细胞的治疗和研究，免疫细胞增殖是有利的。然而，离体培养条件和某些体内环境(例如实体瘤内的环境)对于免疫细胞的生长都不是最佳的。例如，当用抗cd19嵌合抗原受体工程改造时，来自重度预处理的淋巴瘤患者的t细胞显示比来自未处理患者的t细胞更低的离体扩增和临床应答率。因此，需要一种增强人免疫细胞的功能、持久性和增殖的方法，特别是在天然对抗免疫细胞的条件下。[0094]5.3.1t细胞转化元件[0095]增强人免疫细胞的持久性和增殖的一种方法是将增加生长和/或存活的遗传元件整合到免疫细胞的基因组中。用于增强免疫细胞存活的候选遗传元件包括在免疫细胞癌中发现突变的基因。然而，通常认为将细胞转化为癌细胞需要一系列突变，并且每个突变的作用可能与细胞存活或生长不直接相关。例如，已知许多突变仅仅增加发生额外突变的机会。因此，即使可能存在某些基因中的突变经常发生在免疫细胞癌中的相关性，但将相同的突变基因导入免疫细胞通常不会增强增强该细胞的生长或存活。因此可以进行测试以确定包含含有天然突变的基因的异源多核苷酸整合到免疫细胞的基因组中是否将增加该细胞的存活和增殖。[0096]我们试图鉴定可以在异源多核苷酸上提供并整合到免疫细胞的基因组中的基因，以赋予该免疫细胞生长或存活益处。为此，我们合成了包含具有编码天然存在的突变人蛋白质的序列的基因的多核苷酸，该突变人蛋白质包括可操作地连接至对免疫细胞中蛋白质的表达有效的异源启动子的激活突变，并将这些异源多核苷酸整合至t细胞的基因组中。然后如6.2节所述，我们测定了这些t细胞在离体培养中的生长和存活。[0097]5.3.1.1stat3[0098]编码stat3(信号转导子和转录激活子3)的基因在大颗粒淋巴细胞白血病中常发生突变。这些激活突变通常位于stat3的sh2结构域中，并且包括s614r、e616k、g618r、y640f、n647i、e652k、k658y、k658r、k658n、k658m、k658r、k658h、k658n、d661y和d661v。在sh2结构域外还发现了stat3中的激活突变，例如f174s和h410r。如6.2.1.1和6.2.1.5节所述，我们已经证明编码stat3蛋白的激活突变体的异源多核苷酸可以被导入免疫细胞中以增强其存活或其增殖；编码stat3的激活突变体的基因是如6.2节中所述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。本发明的一个实施方案是编码包含stat3修饰形式的蛋白(例如seqidno：232)的多核苷酸，其序列包含选自f174s、h410r、s614r、e616k、g618r、y640f、n647i、e652k、k658y、k658r、k658n、k658m、k658r、k658h、k658n、d661y和d661v的一个或多个突变。示例性突变的stat3蛋白包括seqidno：246-250。优选的实施方案包括包含编码stat3蛋白(包含激活突变)的核酸的多核苷酸，其中该核酸与异源启动子可操作地连接。可与编码stat3的激活突变体的核酸可操作地连接的示例性异源启动子包括ef1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、eef2启动子、泛素启动子、sv40启动子或hsvtk启动子，例如选no：20和21所示的序列。优选的实施方案包括包含编码cd28的激活突变体的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是mariner转座子如睡美人转座子的一部分，其还包含与seqidno：24具有90％同一性的序列和与seqidno：25具有90％同一性的序列。优选的实施方案包括包含编码cd28的激活突变体的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是hat转座子如tcbuster转座子的一部分，其还包含与seqidno：397具有90％同一性的序列和与seqidno：398具有90％同一性的序列。可以将包含编码cd28激活突变体的多核苷酸的转座子与相应的转座酶或编码相应转座酶的多核苷酸一起导入免疫细胞。优选的实施方案包括包含编码cd28的激活突变体的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包含编码cd28的激活突变体的多核苷酸的慢病毒载体可以被包装并用于感染免疫细胞。免疫细胞优选为t细胞。[0102]本发明的一个方面是免疫细胞，其基因组包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸包含编码具有激活突变的cd28蛋白的基因。在一些实施方案中，异源多核苷酸包含慢病毒载体、或piggybac样转座子、或mariner转座子如睡美人转座子、或hat转座子如tcbuster转座子。在一些实施方案中，免疫细胞基因组包含cd28基因的3个拷贝：两个内源拷贝和一个异源突变拷贝。[0103]5.3.1.3rhoa[0104]rhoa小gtp酶在外周t细胞淋巴瘤中经常发生突变。最常见的淋巴瘤相关突变是g17v和k18n。可以将rhoa蛋白的激活突变体导入免疫细胞以增强其存活或增殖；编码rhoa的激活突变体的基因是如6.2节中所述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。本发明的一个实施方案是编码包含rhoa的修饰形式的蛋白(例如，seqidno：234)的多核苷酸，其序列包含选自g17v和k18n的突变或其组合。示例性突变的rhoa蛋白如seqidno：252和253所示。优选的实施方案包括包含编码突变的rhoa蛋白的核酸的多核苷酸，其中该核酸与异源启动子可操作地连接。可与编码突变的rhoa的基因可操作地连接的示例性异源启动子包括ef1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、eef2启动子、泛素启动子、sv40启动子或hsvtk启动子，例如选自seqidno：94-154的序列。优选的实施方案包括包含编码突变的rhoa蛋白的核酸的多核苷酸，其中该核酸可操作地连接到异源聚腺苷酸化信号，例如来自感染哺乳动物细胞的病毒的聚腺苷酸化信号、哺乳动物ef1聚腺苷酸化信号、哺乳动物生长激素聚腺苷酸化信号或哺乳动物珠蛋白聚腺苷酸化信号，例如选自seqidno：160-217的序列。优选的实施方案包括包含编码突变的rhoa蛋白的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是piggybac样转座子的一部分，piggybac样转座子还包含如seqidno：6和7、或seqidno：14和15、或seqidno：18和19、或seqidno：20和21所示的序列。优选的实施方案包括包含编码突变的rhoa蛋白的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是mariner转座子如睡美人转座子的一部分，其还包含与seqidno：24具有90％同一性的序列和与seqidno：25具有90％同一性的序列。优选的实施方案包括包含编码突变的rhoa蛋白的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是hat转座子如tcbuster转座子的一部分，其还包含与seqidno：397具有90％同一性的序列和与seqidno：398具有90％同一性的序列。可以将包含编码突变的rhoa蛋白的多核苷酸的转座子与编码相应转座酶的多核苷酸一起导入免疫细胞中。优选的实施方案包括包含编码突变的rhoa蛋白的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包含编码突变的rhoa蛋白的多核苷酸的慢病毒载体可以被包装并用于感染免疫细胞。免疫细胞优选为t细胞。[0105]本发明的一个方面是免疫细胞，其基因组包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸包含编码具有激活突变的rhoa蛋白的基因。在一些实施方案中，异源多核苷酸包含慢病毒载体、或piggybac样转座子、或mariner转座子如睡美人转座子、或hat转座子如tcbuster转座子。在一些实施方案中，免疫细胞基因组包含rhoa基因的3个拷贝：两个内源拷贝和一个异源突变拷贝。[0106]5.3.1.4磷脂酶c，γ1[0107]激活磷脂酶cγ(plcg)突变与皮肤t细胞淋巴瘤相关。最常见的淋巴瘤相关激活突变为s345f、s520f和r707q。如6.2.1.5节中所述，我们已经证明编码plcg蛋白的激活突变体的异源多核苷酸可以被导入免疫细胞以增强其存活或其增殖；编码plcg的激活突变体的基因是如6.2节中所述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。本发明的一个实施方案是编码包含plcg修饰形式的蛋白(例如，seqidno：235)的多核苷酸，其序列包含选自s345f、s520f和r707q的一个或多个突变。示例性的突变plcg蛋白如seqidno：254所示。优选的实施方案包括包含编码plcg的激活突变体的基因的多核苷酸，其中该核酸与异源启动子可操作地连接。可与编码突变的plcg的基因可操作地连接的示例性异源启动子包括ef1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、eef2启动子、泛素启动子、sv40启动子或hsvtk启动子，例如选自seqidno：94-154的序列。优选的实施方案包括包含编码plcg的激活突变体的核酸的多核苷酸，其中该核酸可操作地连接到异源聚腺苷酸化信号，例如来自感染哺乳动物细胞的病毒的聚腺苷酸化信号、哺乳动物ef1聚腺苷酸化信号、哺乳动物生长激素聚腺苷酸化信号或哺乳动物珠蛋白聚腺苷酸化信号，例如选自seqidno：160-217的序列。优选的实施方案包括包含编码plcg的激活突变体的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是piggybac样转座子的一部分，piggybac样转座子还包含如seqidno：6和7、或seqidno：14和15、或seqidno：18和19、或seqidno：20和21所示的序列。优选的实施方案包括包含编码plcg的激活突变体的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是mariner转座子如睡美人转座子的一部分，其还包含与seqidno：24具有90％同一性的序列和与seqidno：25具有90％同一性的序列。优选的实施方案包括包含编码突变的plcg蛋白的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是hat转座子如tcbuster转座子的一部分，其还包含与seqidno：397具有90％同一性的序列和与seqidno：398具有90％同一性的序列。可以将包含编码突变的plcg蛋白的多核苷酸的转座子与相应的转座酶或编码相应的转座酶的多核苷酸一起导入免疫细胞中。优选的实施方案包括包含编码突变的plcg蛋白的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包含编码突变的plcg蛋白的多核苷酸的慢病毒载体可以被包装并用于感染免疫细胞。免疫细胞优选为t细胞。[0108]本发明的一个方面是免疫细胞，其基因组包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸包含编码具有激活突变的plcg蛋白的基因。在一些实施方案中，异源多核苷酸包含慢病毒载体、或piggybac样转座子、或mariner转座子如睡美人转座子、或hat转座子如tcbuster转座子。在一些实施方案中，免疫细胞基因组包含plcg基因的3个拷贝：两个内源拷贝和一个异源突变拷贝。[0109]5.3.1.5stat5b[0110]编码stat5b(信号转导和转录激活因子5b)的基因在t细胞白血病中有时发生突变。最常见的白血病相关激活突变是sh2结构域中的n642h。与t细胞癌症相关的其他stat5b激活突变包括sh2结构域突变t648s、s652y和y665f，以及sh2结构域外的p267a。可以将编码stat5b蛋白的激活突变体的异源多核苷酸导入免疫细胞中以增强其存活或其增殖；编码stat5b的激活突变体的基因是如6.2节中所述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。本发明的一个实施方案是编码包含stat5b修饰形式的蛋白(例如，seqidno：236)的多核苷酸，其序列包含选自n642h、t648s、s652y、y665f和p267a的一个或多个突变。示例性突变的stat5b蛋白如seqidno：255所示。优选的实施方案包括包含编码突变的stat5b蛋白的核酸的多核苷酸，其中该核酸与异源启动子可操作地连接。可与编码突变的stat5b的基因可操作地连接的示例性异源启动子包括ef1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、eef2启动子、泛素启动子、sv40启动子或hsvtk启动子，例如选自seqidno：94-154的序列。优选的实施方案包括包含编码突变的stat5b蛋白的基因的多核苷酸，其中该基因可操作地连接到异源聚腺苷酸化信号，例如来自感染哺乳动物细胞的病毒的聚腺苷酸化信号、哺乳动物ef1聚腺苷酸化信号、哺乳动物生长激素聚腺苷酸化信号或哺乳动物珠蛋白聚腺苷酸化信号，例如选自seqidno：160-217的序列。优选的实施方案包括包含编码突变的stat5b蛋白的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是piggybac样转座子的一部分，piggybac样转座子还包含如seqidno：6和7、或seqidno：14和15、或seqidno：18和19、或seqidno：20和21所示的序列。优选的实施方案包括包含编码stat5b的激活突变体的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是mariner转座子如睡美人转座子的一部分，其还包含与seqidno：24具有90％同一性的序列和与seqidno：25具有90％同一性的序列。优选的实施方案包括包含编码突变的stat5b蛋白的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是hat转座子如tcbuster转座子的一部分，其还包含与seqidno：397具有90％同一性的序列和与seqidno：398具有90％同一性的序列。可以将包含编码突变的stat5b蛋白的多核苷酸的转座子与相应的转座酶或编码相应的转座酶的多核苷酸一起导入免疫细胞中。优选的实施方案包括包含编码突变的stat5b蛋白的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包含编码突变的stat5b蛋白的多核苷酸的慢病毒载体可以被包装并用于感染免疫细胞。免疫细胞优选为t细胞。[0111]本发明的一个方面是免疫细胞，其基因组包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸包含编码具有激活突变的stat5b蛋白的基因。在一些实施方案中，异源多核苷酸包含慢病毒载体、或piggybac样转座子、或mariner转座子如睡美人转座子、或hat转座子如tcbuster转座子。在一些实施方案中，免疫细胞基因组包含stat5b基因的3个拷贝：两个内源拷贝和一个异源突变拷贝。[0112]5.3.1.6生存素[0113]编码生存素(survivin)(凋亡蛋白家族抑制因子的成员)的基因在t细胞白血病中有时被上调。如6.2.1.3节所述，我们已经证明，编码可操作地连接到异源启动子的生存素基因的异源多核苷酸可以被导入免疫细胞以增强其存活或其增殖，并减少再刺激诱导的细胞死亡；可操作地连接到异源启动子的生存素基因是如6.2节所述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。本发明的一个实施方案是编码包含可操作地连接到异源启动子的seqidno：237的蛋白质的多核苷酸。可与编码生存素的基因可操作地连接的示例性异源启动子包括ef1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、eef2启动子、泛素启动子、sv40启动子或hsvtk启动子，例如选自seqidno：94-154的序列。优选的实施方案包括包含编码生存素的基因的多核苷酸，其中该基因可操作地连接到异源聚腺苷酸化信号，例如来自感染哺乳动物细胞的病毒的聚腺苷酸化信号、哺乳动物ef1聚腺苷酸化信号、哺乳动物生长激素聚腺苷酸化信号或哺乳动物珠蛋白聚腺苷酸化信号，例如选自seqidno：160-217的序列。优选的实施方案包括包含编码生存素的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是piggybac样转座子的一部分，piggybac样转座子还包含如seqidno：6和7、或seqidno：14和15、或seqidno：18和19、或seqidno：20和21所示的序列。优选的实施方案包括包含编码生存素的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是mariner转座子如睡美人转座子的一部分，其还包含与seqidno：24具有90％同一性的序列和与seqidno：25具有90％同一性的序列。优选的实施方案包括包含编码生存素的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是hat转座子如tcbuster转座子的一部分，其还包含与seqidno：397具有90％同一性的序列和与seqidno：398具有90％同一性的序列。可以将包含编码生存素的多核苷酸的转座子与相应的转座酶或编码相应转座酶的多核苷酸一起导入免疫细胞中。优选的实施方案包括包含编码生存素的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包含编码生存素的多核苷酸的慢病毒载体可以被包装并用于感染免疫细胞。免疫细胞优选为t细胞或b细胞。[0114]本发明的一个方面是免疫细胞，其基因组包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸包含编码生存素的基因并且还包含慢病毒载体、或piggybac样转座子、或mariner转座子如睡美人转座子、或hat转座子如tcbuster转座子。在一些实施方案中，免疫细胞基因组包含生存素基因的3个拷贝：与异源启动子可操作地连接的两个内源拷贝和一个异源拷贝。[0115]5.3.1.7bcl-xl[0116]编码bcl-xl(一种抗凋亡蛋白)的基因在b细胞淋巴瘤中有时上调。如6.2.1.5节和6.2.1.6节中所述，我们已经证明，编码可操作地连接到异源启动子的bcl-xl基因的异源多核苷酸可以被导入免疫细胞以增强其存活或其增殖，并减少再刺激诱导的细胞死亡；可操作地连接到异源启动子的bcl-xl基因是如6.2节所述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。本发明的一个实施方案是编码包含可操作地连接到异源启动子的seqidno：238的蛋白质的多核苷酸。可与编码bcl-xl的核酸可操作地连接的示例性异源启动子包括ef1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、eef2启动子、泛素启动子、sv40启动子或hsvtk启动子，例如选自seqidno：94-154的序列。优选的实施方案包括包含编码bcl-xl蛋白的核酸的多核苷酸，其中该核酸可操作地连接到异源聚腺苷酸化信号，例如来自感染哺乳动物细胞的病毒的聚腺苷酸化信号、哺乳动物ef1聚腺苷酸化信号、哺乳动物生长激素聚腺苷酸化信号或哺乳动物珠蛋白聚腺苷酸化信号，例如选自seqidno：160-217的序列。优选的实施方案包括包含编码bcl-xl的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是piggybac样转座子的一部分，piggybac样转座子还包含如seqidno：6和7、或seqidno：14和15、或seqidno：18和19、或seqidno：20和21所示的序列。优选的实施方案包括包含编码bcl-xl的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是mariner转座子如睡美人转座子的一部分，其还包含与seqidno：24具有90％同一性的序列和与seqidno：25具有90％同一性的序列。优选的实施方案包括包含编码bcl-xl的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是hat转座子如tcbuster转座子的一部分，其还包含与seqidno：397具有90％同一性的序列和与seqidno：398具有90％同一性的序列。可以将包含编码bcl-xl的多核苷酸的转座子与编码相应转座酶的多核苷酸一起导入免疫细胞中。优选的实施方案包括包含编码bcl-xl基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包含编码bcl-xl的多核苷酸的慢病毒载体可以被包装并用于感染免疫细胞。免疫细胞优选为t细胞或b细胞。[0117]本发明的一个方面是免疫细胞，其基因组包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸包含编码bcl-xl的基因并且还包含慢病毒载体、或piggybac样转座子、或mariner转座子如睡美人转座子、或hat转座子如tcbuster转座子。在一些实施方案中，免疫细胞基因组包含bcl-xl基因的3个拷贝：与异源启动子可操作地连接的两个内源拷贝和一个异源拷贝。[0118]5.3.1.8ccnd1[0119]编码ccnd1(细胞周期蛋白d1)的基因在白血病中有时发生突变。与癌症相关的ccnd1突变包括e36g、e36q、e36k、a39s、s41l、s41p、s41t、v42e、v42a、v42l、v42m、y44s、y44d、y44c、y44h、k46t、k46r、k46n、k46e、c47g、c47r、c47s、c47w、p199r、p199s、p199l、s201f、t285i、t285a、p286l、p286h、p286s、p286t和p286a。可以将编码ccnd1蛋白的激活突变体的异源多核苷酸导入免疫细胞以增强其存活或其增殖；编码ccnd1的激活突变体的基因是如6.2节中所述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。本发明的一个实施方案是编码包含ccnd1修饰形式的蛋白(例如，seqidno：239)的多核苷酸，其序列包含选自e36g、e36q、e36k、a39s、s41l、s41p、s41t、v42e、v42a、v42l、v42m、y44s、y44d、y44c、y44h、k46t、k46r、k46n、k46e、c47g、c47r、c47s、c47w、p199r、p199s、p199l、s201f、t285i、t285a、p286l、p286h、p286s、p286t和p286a的一个或多个突变。示例性突变的ccnd1蛋白如seqidno：256所示。优选的实施方案包括包含编码突变的ccnd1蛋白的核酸的多核苷酸，其中该核酸与异源启动子可操作地连接。可与编码突变的ccnd1的核酸可操作地连接的示例性异源启动子包括ef1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、eef2启动子、泛素启动子、sv40启动子或hsvtk启动子，例如选自seqidno：94-154的序列。优选的实施方案包括包含编码突变的ccnd1蛋白的核酸的多核苷酸，其中该核酸可操作地连接到异源聚腺苷酸化信号，例如来自感染哺乳动物细胞的病毒的聚腺苷酸化信号、哺乳动物ef1聚腺苷酸化信号、哺乳动物生长激素聚腺苷酸化信号或哺乳动物珠蛋白聚腺苷酸化信号，例如选自seqidno：160-217的序列。优选的实施方案包括包含编码突变的ccnd1蛋白的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是piggybac样转座子的一部分，piggybac样转座子还包含如seqidno：6和7、或seqidno：14和15、或seqidno：18和19、或seqidno：20和21所示的序列。优选的实施方案包括包含编码ccnd1的激活突变体的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是mariner转座子如睡美人转座子的一部分，其还包含与seqidno：24具有90％同一性的序列和与seqidno：25具有90％同一性的序列。优选的实施方案包括包含编码ccnd1的激活突变体的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是hat转座子如tcbuster转座子的一部分，其还包含与seqidno：397具有90％同一性的序列和与seqidno：398具有90％同一性的序列。可以将包含编码突变的ccnd1蛋白的多核苷酸的转座子与编码相应转座酶的多核苷酸一起导入免疫细胞中。优选的实施方案包括包含编码突变的ccnd1蛋白的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包含编码突变的ccnd1蛋白的多核苷酸的慢病毒载体可以被包装并用于感染免疫细胞。免疫细胞优选为t细胞或b细胞。[0120]本发明的一个方面是免疫细胞，其基因组包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸包含编码具有激活突变的ccnd1蛋白的基因。在一些实施方案中，异源多核苷酸包含慢病毒载体、或piggybac样转座子、或mariner转座子如睡美人转座子、或hat转座子如tcbuster转座子。在一些实施方案中，免疫细胞基因组包含ccnd1基因的3个拷贝：两个内源拷贝和一个异源突变拷贝。[0121]5.3.1.9bcl2[0122]编码bcl2(一种抗凋亡蛋白)的基因在b细胞淋巴瘤中有时上调。如6.2.1.4节所述，我们已经证明，编码可操作地连接到异源启动子的bcl2基因的异源多核苷酸可以被导入免疫细胞以增强其存活或其增殖；可操作地连接到异源启动子的bcl2基因是如6.2节所述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。本发明的一个实施方案是编码包含可操作地连接到异源启动子的seqidno：v270或272的蛋白质的多核苷酸。可与编码bcl2的核酸可操作地连接的示例性异源启动子包括ef1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、eef2启动子、泛素启动子、sv40启动子或hsvtk启动子，例如选自seqidno：94-154的序列。优选的实施方案包括包含编码bcl2的核酸的多核苷酸，其中该核酸与异源聚腺苷酸化信号可操作地连接，例如来自感染哺乳动物细胞的病毒的聚腺苷酸化信号、哺乳动物ef1聚腺苷酸化信号、哺乳动物生长激素聚腺苷酸化信号或哺乳动物珠蛋白聚腺苷酸化信号，例如选自seqidno：160-217的序列。优选的实施方案包括包含编码bcl2的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是piggybac样转座子的一部分，piggybac样转座子还包含如seqidno：6和7、或seqidno：14和15、或seqidno：18和19、或seqidno：20和21所示的序列。优选的实施方案包括包含编码bcl2的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是mariner转座子如睡美人转座子的一部分，其还包含与seqidno：24具有90％同一性的序列和与seqidno：25具有90％同一性的序列。优选的实施方案包括包含编码bcl2的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是hat转座子如tcbuster转座子的一部分，其还包含与seqidno：397具有90％同一性的序列和与seqidno：398具有90％同一性的序列。可以将包含编码bcl2的多核苷酸的转座子与编码相应转座酶的多核苷酸一起导入免疫细胞中。优选的实施方案包括包含编码bcl2的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包含编码bcl2的多核苷酸的慢病毒载体可以被包装并用于感染免疫细胞。免疫细胞优选为t细胞或b细胞。[0123]本发明的一个方面是免疫细胞，其基因组包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸包含编码bcl2的基因并且还包含慢病毒载体、或piggybac样转座子、或mariner转座子如睡美人转座子、或hat转座子如tcbuster转座子。在一些实施方案中，免疫细胞基因组包含bcl2基因的3个拷贝：与异源启动子可操作地连接的两个内源拷贝和一个异源拷贝。[0124]5.3.1.10bcl6[0125]编码bcl6(一种抗凋亡蛋白)的基因在b细胞淋巴瘤中有时上调。如6.2.1.4节所述，我们已经证明，编码可操作地连接到异源启动子的bcl6基因的异源多核苷酸可以被导入免疫细胞以增强其存活或其增殖，并减少再刺激诱导的细胞死亡；可操作地连接到异源启动子的bcl6基因是如6.2节所述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。本发明的一个实施方案是编码包含可操作地连接到异源启动子的seqidno：271或272的蛋白质的多核苷酸。可与编码bcl6的核酸可操作地连接的示例性异源启动子包括ef1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、eef2启动子、泛素启动子、sv40启动子或hsvtk启动子，例如选自seqidno：94-154的序列。优选的实施方案包括包含编码bcl6的核酸的多核苷酸，其中该核酸与异源聚腺苷酸化信号可操作地连接，例如来自感染哺乳动物细胞的病毒的聚腺苷酸化信号、哺乳动物ef1聚腺苷酸化信号、哺乳动物生长激素聚腺苷酸化信号或哺乳动物珠蛋白聚腺苷酸化信号，例如选自seqidno：160-217的序列。优选的实施方案包括包含编码bcl6的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是piggybac样转座子的一部分，piggybac样转座子还包含如seqidno：6和7、或seqidno：14和15、或seqidno：18和19、或seqidno：20和21所示的序列。优选的实施方案包括包含编码bcl6的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是mariner转座子如睡美人转座子的一部分，其还包含与seqidno：24具有90％同一性的序列和与seqidno：25具有90％同一性的序列。优选的实施方案包括包含编码bcl6的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是hat转座子如tcbuster转座子的一部分，其还包含与seqidno：397具有90％同一性的序列和与seqidno：398具有90％同一性的序列。可以将包含编码bcl6的多核苷酸的转座子与相应的转座酶或编码相应转座酶的多核苷酸一起导入免疫细胞中。优选的实施方案包括包含编码bcl6的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包含编码bcl6的多核苷酸的慢病毒载体可以被包装并用于感染免疫细胞。免疫细胞优选为t细胞或b细胞。[0126]本发明的一个方面是免疫细胞，其基因组包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸包含编码bcl6的基因并且还包含慢病毒载体或piggybac样转座子。在一些实施方案中，免疫细胞基因组包含bcl6基因的3个拷贝：与异源启动子可操作地连接的两个内源拷贝和一个异源拷贝。[0127]5.3.2增强型信号传导受体[0128]免疫细胞例如t细胞表达膜蛋白，该膜蛋白包含结合天然存在的和合成的配体的胞外结构域、跨膜结构域以及与细胞内信号传导通路相互作用的胞内结构域。我们已经设计、合成和测试了一组嵌合受体，我们称其为增强型信号传导受体(esrs)，其包含衍生自第一蛋白的胞外结构域、跨膜结构域和衍生自将刺激或共刺激信号传递至免疫细胞的受体的胞内结构域。然而，与嵌合抗原受体不同，esrs不包含含有cd3ζ链的细胞内部分的序列。esrs的一个功能是增强免疫细胞存活。esr的另一个功能是例如通过作用于抑制性受体的肿瘤细胞来抵消t细胞抑制性通路的参与(tay等人，2017.immunotherapy9，1339-1349)。为了使esr有效发挥功能，它们必须以足够高的水平表达，以与天然抑制性受体竞争肿瘤微环境内存在的抑制性配体。[0129]在一个实施方案中，esr的胞外结构域可以衍生自向免疫细胞天然传递抑制信号的受体的胞外配体结合结构域：在这种情况下，esr接收通常解释为抑制信号的信号并将其转导为刺激信号。例如，esr的胞外结构域可以包含衍生自选自以下的蛋白质的胞外结构域的序列：tnfrsf1a、tnfrsf3(ltrβ)、tnfrsf6(fas)、tnfrsf8(cd30)、tnfrsf10a(dr4)、tnfrsf10b(dr5)、tnfrsf19(troy)、tnfrsf21(dr6)和ctla4；优选地，胞外结构域衍生自人蛋白。在本发明的一些实施方案中，esr的胞外结构域包含多肽，该多肽的序列与选自seqidno：322-330的序列具有至少90％同一性、或至少95％同一性、或至少96％同一性、或至少97％同一性、或至少98％同一性、或至少99％或100％同一性。[0130]在另一个实施方案中，esr的胞外结构域可能衍生自与免疫细胞表面表达的蛋白质结合的蛋白质，优选其正常功能是刺激免疫功能的蛋白质：在这种情况下，esr将刺激信号传递至另一种免疫细胞并将刺激信号转导至其所表达的免疫细胞。例如，esr胞外结构域可包含抗体、单链抗体、单域抗体、纳米抗体、vhh片段或vnar片段的可变域，其结合选自以下的蛋白质的胞外结构域：tnfrsf4(ox40)、tnfrsf5(cd40)、tnfrsf7(cd27)、tnfrsf9(4-1bb)、tnfrsf11a(rank)、tnfrsf13b(taci)、tnfrsf13c(baff-r)、tnfrsf14(hvem)、tnfrsf17(cd269)、tnfrsf18(gitr)、cd28、cd28h(tmigd2)、诱导型t细胞共刺激因子(icos/cd278)、dnax辅助分子1(dnam-1/cd226)、信号转导淋巴细胞激活分子(slam/cd150)、t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域(tim-1/havcr-1)、干扰素受体α链(ifnar1)、干扰素受体β链(ifnar2)、白细胞介素2受体β亚基(il2rb)和白细胞介素2受体γ亚基(il2rg)。示例性的单链抗cd28抗体为ttgn1412，其序列如seqidno：340所示。[0131]在另一个实施方案中，esr的胞外结构域可能衍生自与免疫细胞表面表达的受体结合的配体，优选其正常功能是转导免疫细胞中的刺激或共刺激信号的受体：在这种情况下，esr将刺激信号传递至另一种免疫细胞并将刺激信号转导至其所表达的免疫细胞。例如，esr胞外结构域可包含衍生自选自以下的蛋白的胞外结构域的序列：tnfsf4(ox40配体)、tnfsf5(cd40配体)、tnfsf9(4-1bb配体)、tnfsf11(rankl)、tnfsf14(hvem配体)、tnfsf13b、cd80、cd86和icos配体；优选地，胞外结构域衍生自人蛋白。在本发明的一些实施方案中，esr的胞外结构域包含多肽，该多肽的序列与选自seqidno：331-339的序列具有至少90％同一性、或至少95％同一性、或至少96％同一性、或至少97％同一性、或至少98％同一性、或至少99％同一性。[0132]在本发明的一些实施方案中，增强型信号传导受体包含衍生自肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)成员或通常将刺激信号传递至免疫细胞的另一种免疫细胞受体的胞内结构域的序列；在本发明的一些实施方案中，esr包含衍生自选自以下蛋白质的胞内结构域的序列：tnfrsf4(ox40)、tnfrsf5(cd40)、tnfrsf7(cd27)、tnfrsf9(4-1bb)、tnfrsf11a(rank)、tnfrsf13b(taci)、tnfrsf13c(baff-r)、tnfrsf14(hvem)、tnfrsf17(cd269)、tnfrsf18(gitr)、cd28、cd28h(tmigd2)、诱导型t细胞共刺激因子(icos/cd278)、dnax辅助分子1(dnam-1/cd226)、信号转导淋巴细胞激活分子(slam/cd150)、t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域(tim-1/havcr-1)、干扰素受体α链(ifnar1)、干扰素受体β链(ifnar2)、白细胞介素2受体β亚基(il2rb)、白细胞介素2受体γ亚基(il2rg)、肿瘤坏死因子超家族14(tnfsf14/light)、自然杀伤细胞2族成员d(nkg2d/cd314)和cd40配体(cd40l)；优选地，胞内结构域为人蛋白的胞内结构域。在本发明的一些实施方案中，esr包含多肽，该多肽的序列与选自seqidno：341-364的序列具有至少90％同一性、或至少95％同一性、或至少96％同一性、或至少97％同一性、或至少98％同一性、或至少99％或100％同一性。[0133]在本发明的一些实施方案中，增强型信号传导受体包含衍生自肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)成员或通常将抑制或刺激信号传递至免疫细胞的另一种免疫细胞受体的跨膜结构域的序列；在本发明的一些实施方案中，esr包含衍生自选自以下的蛋白质的跨膜结构域的序列：tnfrsf1a、tnfrsf1b、tnfrsf3(ltrβ)、tnfrsf6(fas)、tnfrsf8(cd30)、tnfrsf10a(dr4)、tnfrsf10b(dr5)、tnfrsf19(troy)、tnfrsf21(dr6)、ctla4、tnfrsf4(ox40)、tnfrsf5(cd40)、tnfrsf7(cd27)、tnfrsf9(4-1bb)、tnfrsf11a(rank)、tnfrsf13b(taci)、tnfrsf13c(baff-r)、tnfrsf14(hvem)、tnfrsf17(cd269)、tnfrsf18(gitr)、cd28、cd28h(tmigd2)、诱导型t细胞共刺激因子(icos/cd278)、dnax辅助分子1(dnam-1/cd226)、信号转导淋巴细胞激活分子(slam/cd150)、t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域(tim-1/havcr-1)、干扰素受体α链(ifnar1)、干扰素受体β链(ifnar2)、白细胞介素2受体β亚基(il2rb)、白细胞介素2受体γ亚基(il2rg)、肿瘤坏死因子超家族14(tnfsf14/light)、自然杀伤细胞2族成员d(nkg2d/cd314)和cd40配体(cd40l)。优选地，跨膜结构域为人蛋白；在本发明的一些实施方案中，esr包含多肽，该多肽的序列与选自seqidno：365-396的序列具有至少90％同一性、或至少95％同一性、或至少96％同一性、或至少97％同一性、或至少98％同一性、或至少99％或100％同一性。[0134]在本发明的一些实施方案中，增强型信号传导受体包含与选自seqidno：274-318的序列具有至少90％同一性、或至少95％同一性、或至少96％同一性、或至少97％同一性、或至少98％同一性、或至少99％或100％同一性的序列。这些序列包含n末端分泌信号(例如mlgiwtllplvltsvarlssksvna、meqrprgcaavaaalllvllgaraqg、mglstvpdlllplvllellvgiypsgvig、mgtspssstalascsriarratatmiagsllllgflsttta、meqrgqnapaasgarkrhgpgpreargarpgprvpktlvlvvaavlllvsaes和mavmaprtlvlllsgalaltqtwa是用于这些esrs的信号序列)。信号序列的功能是将esr转移到膜中。esr的信号序列被信号肽酶去除，并且不形成最终受体的一部分，因此任何功能性分泌信号都可以被另一功能性分泌信号替代，而不改变esr的活性。明确考虑了这样的替代。增强型信号传导受体包含与选自seqidno：274-318的序列的非信号序列部分具有至少90％同一性、或至少95％同一性、或至少96％同一性、或至少97％同一性、或至少98％同一性、或至少99％或100％同一性的序列。[0135]在本发明的一些实施方案中，编码esr的基因在免疫细胞例如t细胞中表达，并增加免疫细胞的存活或增殖、或t细胞杀伤肿瘤微环境内的细胞的能力。本发明的一个方面是免疫细胞，其基因组包含编码esr的基因，esr增加免疫细胞的存活或增殖或t细胞杀伤肿瘤微环境内的细胞的能力。[0136]优选的实施方案包括包含编码esr的基因的多核苷酸，其中该基因与异源启动子可操作地连接。可与编码esr的基因可操作地连接的示例性异源启动子包括ef1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、eef2启动子、泛素启动子、sv40启动子或hsvtk启动子，例如选自seqidno：94-154的序列。优选的实施方案包括包含编码esr的基因的多核苷酸，其中该基因与异源聚腺苷酸化信号可操作地连接，例如来自感染哺乳动物细胞的病毒的聚腺苷酸化信号、哺乳动物ef1聚腺苷酸化信号、哺乳动物生长激素聚腺苷酸化信号或哺乳动物珠蛋白聚腺苷酸化信号，例如选自seqidno：160-217的序列。一些实施方案包括包含编码esr的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包含编码esr的多核苷酸的慢病毒载体可以被包装并用于感染免疫细胞。更优选地，esr由基因转移多核苷酸编码，该基因转移多核苷酸是piggybac样转座子的一部分，例如一种还包含如seqidno：6和7、或seqidno：14和15、或seqidno：18和19、或seqidno：20和21所示的序列的多核苷酸。esr可由基因转移多核苷酸编码，该基因转移多核苷酸是mariner转座子如睡美人转座子的一部分，还包含与seqidno：24具有90％同一性的序列和与seqidno：25具有90％同一性的序列。esr可由基因转移多核苷酸编码，该基因转移多核苷酸是hat转座子例如tcbuster转座子的一部分，还包含与seqidno：397具有90％同一性的序列和与seqidno：398具有90％同一性的序列。包含转座子和编码esr的多核苷酸的基因转移多核苷酸还可包含编码嵌合抗原受体的基因。可以将基因转移多核苷酸与相应的转座酶一起导入免疫细胞，该转座酶可以作为编码转座酶的多核苷酸提供。免疫细胞优选为t细胞。[0137]本发明的一个方面是免疫细胞，其基因组包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸包含编码esr的基因。在一些实施方案中，异源多核苷酸包含慢病毒载体、或piggybac样转座子、或mariner转座子如睡美人转座子、或hat转座子如tcbuster转座子。[0138]在一些实施方案中，在免疫细胞中表达的第二基因增强esr的作用以增加免疫细胞的存活或增殖。本发明的一个方面是免疫细胞，其基因组包含编码esr的基因和增强esr的活性以增加免疫细胞的存活或增殖的第二基因(esr增强基因(esrpotentiatinggene))。在一些实施方案中，第二基因与异源启动子可操作地连接；在一些实施方案中，第二基因编码凋亡通路的抑制因子；在一些实施方案中，凋亡通路的抑制因子是半胱天冬酶通路中的显性失活基因，例如半胱天冬酶3(caspase3)、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10或casp8和fadd样凋亡调节剂(cflar)的显性失活突变体；在一些实施方案中，凋亡通路的抑制因子包含选自seqidno：240-245的序列的显性失活突变体；在一些实施方案中，凋亡通路的抑制因子包含选自seqidno：237、238或261-272的序列。[0139]优选地，相对于不表达免疫细胞存活增强基因的免疫细胞的半衰期，表达esr和esr增强基因的免疫细胞的半衰期增加至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少100％。优选地，相对于不表达免疫细胞存活增强基因的免疫细胞的最大寿命，表达esr和esr增强基因的免疫细胞的最大寿命增加至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少100％。优选地，相对于表达esr和esr增强基因的免疫细胞的倍增时间，不表达esr和esr增强基因的免疫细胞的倍增时间高出至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少100％。优选地，相对于不表达esr和esr增强基因的免疫细胞的增殖速率，表达esr和esr增强基因的免疫细胞的增殖速率增加至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少100％。[0140]优选的实施方案包括包含编码凋亡抑制因子(inhibitorofapoptosis)的核酸的多核苷酸，其中该核酸与异源启动子可操作地连接。可与编码凋亡抑制因子的基因可操作地连接的示例性异源启动子包括ef1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、eef2启动子、泛素启动子、sv40启动子或hsvtk启动子，例如选自seqidno：94-154的序列。优选的实施方案包括包含编码凋亡抑制因子的核酸的多核苷酸，其中该核酸与异源聚腺苷酸化信号可操作地连接，例如来自感染哺乳动物细胞的病毒的聚腺苷酸化信号、哺乳动物ef1聚腺苷酸化信号、哺乳动物生长激素聚腺苷酸化信号或哺乳动物珠蛋白聚腺苷酸化信号，例如选自seqidno：160-217的序列。优选的实施方案包括包含编码凋亡抑制因子的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是piggybac样转座子的一部分，piggybac样转座子还包含如seqidno：6和7、或seqidno：14和15、或seqidno：18和19、或seqidno：20和21所示的序列。优选的实施方案包括包含编码凋亡抑制因子的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是mariner转座子如睡美人转座子的一部分，其还包含与seqidno：24具有90％同一性的序列和与seqidno：25具有90％同一性的序列。优选的实施方案包括包含编码凋亡抑制因子的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是hat转座子如tcbuster转座子的一部分，其还包含与seqidno：397具有90％同一性的序列和与seqidno：398具有90％同一性的序列。可以将包含编码凋亡抑制因子的多核苷酸的piggybac样转座子与编码相应转座酶的多核苷酸一起导入免疫细胞中。优选的实施方案包括包含编码凋亡抑制因子的基因的多核苷酸，其中该多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包含编码凋亡抑制因子的多核苷酸的慢病毒载体可以被包装并用于感染免疫细胞。免疫细胞优选为t细胞或b细胞。[0141]本发明的一个方面是免疫细胞，其基因组包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸包含编码凋亡抑制因子的基因。在一些实施方案中，异源多核苷酸包含慢病毒载体、或piggybac样转座子、或mariner转座子如睡美人转座子、或hat转座子如tcbuster转座子。[0142]任选地，包含编码esr的基因的多核苷酸还包含与异源启动子可操作地连接的编码凋亡抑制因子的第二基因。[0143]5.3.2.1fas/4-1bb[0144]作为示例性esr，其中抑制性受体的胞外结构域与共刺激受体的胞内结构域融合，我们设计了一种esr，其包含tnfrsf6(fas)的胞外结构域(seqidno：323)并且还包含tnfrsf6(fas)的跨膜结构域(seqidno：387)并且还包含tnfrsf9(4-1bb)的胞内结构域(seqidno：344)。这种包含序列seqidno：274的esr(fas/4-1bb)是如6.2节中所述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。[0145]fas/4-1bb的活性通过凋亡抑制因子casp7的显性失活形式casp7-dn(seqidno：262)增强。fas/4-1bb和casp7-dn增强免疫细胞存活和增殖的作用见6.2.1.2和6.2.2.2节。[0146]本发明的一个方面是包含编码fas/4-1bb(seqidno：274)的基因的多核苷酸。本发明的一个方面是基因组包含编码fas/4-1bb的基因的免疫细胞。本发明的一个方面是包含编码fas/4-1bb的基因并且还包含编码凋亡抑制因子的基因的多核苷酸；在一些实施方案中，凋亡抑制因子是casp7的显性失活突变体，例如seqidno：262。优选地，多核苷酸是转座子。本发明的一个方面是基因组包含编码fas/4-1bb和显性失活凋亡抑制因子(dominantnegativeinhibitorofapoptosis)的基因的免疫细胞。这种免疫细胞特别有利于细胞培养中的离体生长。[0147]5.3.2.2抗cd28/ox40是具有增殖增强活性的esr[0148]作为示例性esr，其中胞外结构域包含来自与共刺激受体的胞内结构域融合的抗体的结合结构域，我们设计了一种esr，其胞外结构域包含与tnfrsf4(ox40)的跨膜结构域(seqidno：373)和tnfrsf4(ox40)的胞内结构域(seqidno：341)融合的cd28激动剂抗体tgn1412的结合结构域(seqidno：340)。抗cd28/ox40esr的序列如(seqidno：307)所示。在6.2.2.1节中描述了这种esr促进t细胞增殖的有效性。[0149]本发明的一个方面是包含编码抗cd28/ox40esr(例如seqidno：34)的基因的多核苷酸。本发明的一个方面是基因组包含编码抗cd28/ox40esr的基因的免疫细胞。这种免疫细胞特别有利于细胞培养中的离体生长。[0150]5.4试剂盒[0151]本发明的特征还在于试剂盒，其包含作为蛋白质或由核酸编码的转座酶和/或转座子；或如本文所述的基因转移系统，其包含与转座子组合的作为蛋白质或由如本文所述的核酸编码的转座酶；任选地具有药学上可接受的载体、佐剂或媒介物，并且任选地具有使用说明书。本发明试剂盒的任何组分可以随后的顺序或平行地施用和/或转染到细胞中，例如转座酶蛋白或其编码核酸可以在施用和/或转染转座子之前、同时或之后施用和/或转染到如上定义的细胞中。或者，可以在转染转座酶蛋白或其编码核酸之前、同时或之后，将转座子转染到如上定义的细胞中。如果平行转染，优选地，两种组分以单独的制剂提供和/或在施用前直接彼此混合以避免转染前转座。另外，试剂盒的至少一种组分的施用和/或转染可以以时间交错的方式发生，例如通过施用该组分的多剂量。[0152]6.实施例[0153]以下实施例说明了本文公开的方法、组合物和试剂盒，并且不应被解释为以任何方式限制。从以下实施例中各种等同物将变得明显；这些等同物也被认为是本文公开的本发明的一部分。[0154]6.1用于在免疫细胞中表达的基因转移系统元件[0155]6.1.1人t细胞系中的转座子元件[0156]jurkat细胞是一种永生化人t细胞系，它们可用于测试基因转移系统在人免疫细胞、特别是t细胞中的有效性。我们测试了爪蟾和家蚕piggybac样转座酶将它们相应的转座子转座到jurkat人t细胞系的基因组中的能力。[0157]构建了一种包含爪蟾转座子的多核苷酸(cd19-gfp-lpn1，核苷酸序列如seqidno：223所示)，其中编码cd19(氨基酸序列如seqidno：228所示)的核酸与序列如seqidno：94所示的ef1启动子和如seqidno：174所示的牛生长激素多腺苷酸化信号序列可操作地连接。cd19基因的一侧侧翼为hs4绝缘子(seqidno：92)，另一侧侧翼为d4z4绝缘子(seqidno：88)。基因转移多核苷酸在一个绝缘子的远端还包含靶序列5'ttaa-3'，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：itr8(其为seqidno：6的一个实施方案)，紧接着是如seqidno：1所示的额外转座子末端序列。基因转移多核苷酸在另一绝缘子的远端还包含如seqidno：4所示的额外转座子末端序列，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：9(其为seqidno：7的一个实施方案)，紧接着是靶序列5'ttaa-3'。转座子还包含与cmv启动子和牛生长激素多腺苷酸化信号序列可操作地连接的编码gfp的多核苷酸。cd19和gfp基因放置成使得piggybac样爪蟾转座子通过其相应的转座酶转座cd19基因，但将gfp基因留在质粒中。[0158]构建了一种包含家蚕转座子的多核苷酸(cd19-rfp-lpn2，核苷酸序列如seqidno：224所示)，其中编码cd19的基因(seqidno：228)与序列如seqidno：94所示的ef1启动子和如seqidno：174所示的牛生长激素多腺苷酸化信号序列可操作地连接。cd19基因的一侧侧翼为hs4绝缘子(seqidno：92)，另一侧侧翼为d4z4绝缘子(seqidno：88)。基因转移多核苷酸在一个绝缘子的远端还包含靶序列5'ttaa-3'，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：14，紧接着是如seqidno：12所示的额外转座子末端序列。基因转移多核苷酸在另一绝缘子的远端还包含如seqidno：13所示的额外转座子末端序列，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：15，紧接着是靶序列5'ttaa-3'。转座子还包含与cmv启动子和牛生长激素多腺苷酸化信号序列可操作地连接的编码rfp的多核苷酸。将cd19和rfp基因放置成使得piggybac样家蚕转座子通过其相应的转座酶转座cd19基因，但将rfp基因留在质粒中。[0159]根据制造商的说明书，使用neon电穿孔仪，用1μgcd19-gfp-lpn1质粒dna和100ng编码序列如eqidno：37所示的爪蟾转座酶的转座酶mrna转染一份jurkat细胞样品(每次转染200,000个细胞)。根据制造商的说明书，使用neon电穿孔仪，用1μgcd19-rfp-lpn2质粒dna和100ng编码序列如seqidno：68所示的转座酶的家蚕转座酶mrna转染两份jurkat细胞样品(每次转染200,000个细胞)。不同时间后，用抗cd19抗体标记细胞，并通过流式细胞术测定表达cd19的细胞的百分比。结果如表1所示。最初约85％的转染细胞显示出cd19表达(表1第1行)。这对应于已摄入细胞的质粒和已稳定整合到t细胞系基因组中的转座子的表达组合。在接下来的10天内，对于用爪蟾piggybac样转座子转染的细胞，表达cd19的细胞的百分比降至18％，而对于用家蚕piggybac样转座子转染的细胞，表达cd19的细胞的百分比降至27％(表1第3行)。这对应于cd19基因尚未整合到基因组中的细胞表达缺失。从转染后约15天直到转染后至少55天，表达cd19的细胞的百分比保持大致恒定(表1第3-6行)。在此期间，细胞一直在生长和分裂。质粒在人体细胞中无法复制，因此细胞保持表达cd19的唯一途径是如果cd19基因整合到基因组中，然后在每次细胞分裂时复制cd19基因以及基因组的其余部分。通过随机片段化的整合率非常低：预计有0.01％到1％的细胞会整合转染的dna。整合cd19基因的细胞百分比远高于随机整合所预期的频率，但与转座所预期的频率一致。还分析了细胞的gfp和rfp的表达。到第55天，没有可检测的gfp或rfp表达。如上所述，将gfp和rfp基因置于不能被转座酶转座的基因转移质粒的一部分上。因此，如果基因转移质粒已经通过随机片段化和整合而整合到细胞基因组中，可以预期gfp和rfp表达。然而，如果cd19基因由于转座而整合，gfp或rfp基因将留在质粒中并将随时间逐渐降解。高的基因组整合频率和缺乏非转座基因的表达导致我们得出这样的结论：基于爪蟾和家蚕piggybac样转座子系统的基因转移系统都能够将多核苷酸整合到人t细胞中。[0160]在转染后70天，我们使用荧光激活细胞分选来从不表达cd19的细胞中分选表达cd19的细胞。然后将这些细胞在液体培养物中维持240天以上，并在不同时间分析以评估整合的稳定性。图1显示了转染后155天和facs分选后85天，y轴上cd19的表达，x轴上荧光蛋白的表达。基本上所有细胞仍然表达cd19，但没有细胞表达荧光蛋白。转染后240天获得了相同的结果。我们得出结论，爪蟾和家蚕piggybac样转座子即使在没有选择压力的情况下也稳定维持了至少240天。我们还注意到维持表达表明在转座子上编码的基因在超过200代的细胞中没有沉默。因此，基于爪蟾(xenopus)和家蚕(bomby)pigybac样转座子系统的基因转移系统都可用于将用于表达的基因递送到人t细胞中。[0161]6.1.2t细胞中的启动子元件[0162]6.1.2.1jurkat细胞中的启动子测试[0163]jurkat细胞是一种永生化人t细胞系，它们可用于测试基因转移系统在人免疫细胞、特别是t细胞中的有效性。[0164]通过将启动子元件(任选地与内含子元件组合)导入序列如seqidno：218所示的第一多核苷酸和序列如seqidno：219所示的第二多核苷酸之间，将它们克隆到转座子中用于表达人cd19，以产生环状质粒，其包含序列如seqidno：90所示的绝缘子序列、序列如seqidno：93所示的绝缘子序列、并且侧翼为一对转座子末端，其中一个包含seqidno：6的实施方案中的序列seqidno：8，且一个包含seqidno：7的实施方案中的序列seqidno：9。根据制造商的说明书，使用neon电穿孔仪，用1μg质粒dna和100ng编码具有氨基酸序列seqidno：37的爪蟾转座酶的转座酶mrna转染jurkat细胞(每次转染200,000个细胞)。[0165]在转染后的不同时间取样进行facs分析，对其表面表达cd19的活细胞分数进行计数，并示于表2中。表2显示cd19可操作地连接至ef1(例如seqidno：94和132)和eef2(例如seqidno：108)的细胞显示出高初始百分比的cd19表达细胞(d列)，但这不是持续的(例如f和g列)。例如，在第2天和第23天，表达大鼠ef1-驱动的cd19的细胞的百分比从87％降至25％，类似地，在第2天和第23天，表达人ef1-驱动的cd19的细胞的百分比从76％降至37％。相反，当cd19与gapdh、泛素和pgk启动子可操作地连接时，细胞显示出更加一致的持续表达水平，约50％的细胞在第2天和第23天之间的每个采样时间表达cd19(d-g列)。h列显示了在第2天和第23天之间表达cd19的细胞的百分比下降。[0166]cd19是在细胞表面表达的分子。跨膜蛋白的大量过度表达可能是有毒的。因此，我们推测，表现出表达cd19细胞的最显著损失的启动子可能是那些驱动最强表达的启动子。为了评估启动子强度，我们将每个启动子与编码gfp的基因可操作地连接，并将基因一式三份地转染到hek细胞中。2天后，在荧光计中测量荧光。平均荧光值示于表2i列中。最强的启动子是ef1和eef2(i列，1、2和6行)，并且这些是相同的启动子，它们在表达cd19的细胞百分比方面表现出最显著的下降(表2，h列)。相反，pgk、gapdh和泛素启动子的活性仅为最强ef1启动子的8.6％、28％和22％，但与这些启动子可操作地连接的表达cd19的细胞的百分比是持续的。因此，对于在t细胞中表达编码跨膜蛋白的基因而言，中等活性的启动子似乎优于高活性的启动子，因为它们产生足够高水平的跨膜蛋白以实现功能而不引起毒性。跨膜蛋白包括t细胞受体、嵌合抗原受体和增强型信号传导受体。中度活性启动子包括磷酸甘油酸激酶启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子和泛素启动子。它们还可以包括已经被减毒的高活性启动子，例如通过去除内含子或启动子的部分缺失，例如减毒ef1启动子或减毒eef2启动子。[0167]这是意料不到的结果：目前在表达嵌合抗原受体方面的大部分工作是用强活性启动子如cmv或ef1启动子进行的。相反，本文中我们已经发现这样的高活性启动子在可操作地连接到跨膜蛋白时是不利的。用于在t细胞中表达编码跨膜蛋白的基因的有利基因转移系统包含多核苷酸，该多核苷酸包含与选自磷酸甘油酸激酶启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、泛素启动子、减毒ef1启动子或减毒eef2启动子的启动子可操作地连接的编码跨膜蛋白的基因。示例性磷酸甘油酸激酶启动子序列如seqidno：115-118所示。例示性甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子序列如seqidno：97-107所示。示例性泛素启动子序列如seqidno：95和125-127所示。多核苷酸还可以包含选自seqidno：87-93的绝缘子序列。优选地，基因转移多核苷酸包含转座子末端，使得其被相应的转座酶识别和转座，使得这种转座可以将启动子及其可操作地连接的基因插入到免疫细胞例如t细胞的基因组中。多核苷酸可以是piggybac样转座子的一部分，piggybac样转座子还包含如seqidno：6和7、或seqidno：14和15、或seqidno：18和19、或seqidno：20和21所示的序列。多核苷酸可以是mariner转座子如睡美人转座子的一部分，mariner转座子还包含与seqidno：24具有90％同一性的序列和与seqidno：25具有90％同一性的序列。多核苷酸可以是hat转座子例如tcbuster转座子的一部分，hat转座子还包含与seqidno：397具有90％同一性的序列和与seqidno：398具有90％同一性的序列。重复进行实验，8天后用抗cd19抗体标记细胞，并通过流式细胞术测量第8天表达cd19的细胞的平均荧光强度。平均荧光强度值示于表3的d列中。为了进行比较，对每个细胞以大约22,000个分子自然表达cd19的人类b细胞进行了标记，并测量了平均荧光强度。如表3的e列中所示，使用b细胞的平均荧光强度来计算在jurkat细胞表面上表达的cd19分子的数量。对于所有测试的启动子，每个细胞表面上cd19分子的数量是在b细胞上天然发现的数量的2-5倍。用可操作地连接至ef1启动子的cd19转染的细胞的平均荧光强度在用可操作地连接至pgk启动子的cd19转染的细胞的值的20％内(比较表3第5行和第6行)，即使已知pgk启动子的活性远低于ef1启动子，例如如表2第i列第5和第6行所示。我们认为这是因为其中cd19的表达超过b细胞表面正常数量约5倍的细胞会经历毒性。ef1是一种更强的启动子，因此用与ef1启动子可操作地连接的cd19转染的细胞中有更高细胞超过该毒性极限并死亡。这导致在表2第6行的第2天和第8天之间观察到表达cd19的细胞的损失。因此，中度活性启动子能够产生高水平的跨膜蛋白表达，但该水平不太可能高到产生毒性。这在用跨膜蛋白如嵌合抗原受体转染t细胞中是有利的。[0168]表3显示序列如seqidno：94、95、98、108、115和132所示的启动子都有效驱动了jurkat永生化t细胞中高水平的cd19表达。用于在t细胞中表达基因的有利的基因转移系统包含多核苷酸，该多核苷酸包含具有选自seqidno：94、95、98、108、115和132的序列的启动子。用于在t细胞中表达基因的有利的基因转移系统包含多核苷酸，该多核苷酸包含选自seqidno：87-91的绝缘子序列和选自seqidno：92和93的绝缘子序列。用于在t细胞中表达基因的有利的基因转移系统包含多核苷酸，该多核苷酸包含含有序列seqidno：6的转座子末端和含有序列seqidno：7的转座子末端。[0169]6.1.2.2原代t细胞中的启动子测试[0170]通过将启动子元件导入序列如seqidno：220所示的第一多核苷酸和序列如seqidno：221所示的第二多核苷酸之间，将它们克隆到用于表达人cd19的转座子中，以产生环状质粒，其包含序列如seqidno：88所示的绝缘子序列、序列如seqidno：92所示的绝缘子序列、并且侧翼为一对转座子末端，其中一个包含靶位点5'-ttaa-3'、紧接着序列seqidno：8、紧接着序列seqidno：1，另一个包含序列seqidno：4、紧接着序列seqidno：9、紧接着靶位点5'-ttaa-3'。根据制造商的说明书，使用neon电穿孔仪，用1μg质粒dna和100ng编码具有多肽序列seqidno：37的爪蟾转座酶的转座酶mrna转染原代t细胞(每次转染200,000个细胞)。11天后，用抗cd19抗体标记细胞并通过流式细胞术测量平均荧光强度。[0171]表4显示序列如seqidno：97、98和108-114所示的启动子均有效驱动了原代t细胞中高水平的cd19表达。它进一步显示通过使用不同的启动子可以获得不同的表达水平。用于在t细胞中表达基因的有利的基因转移系统包含多核苷酸，该多核苷酸包含具有选自seqidno：97、98和108-114的序列的启动子。用于在t细胞中表达基因的有利的基因转移系统包含多核苷酸，该多核苷酸包含含有序列seqidno：8、紧接着是序列seqidno：1的转座子末端，以及含有序列seqidno：4、紧接着是seqidno：9的转座子末端。[0172]6.2用于增强免疫细胞的存活和功效的元件[0173]本发明的一个方面是公开了可用于增强免疫细胞存活、增殖或扩增的序列。[0174]细胞存活可以测量为群体中只有一半细胞保持存活所用的时间长度(半衰期)，或群体中所有细胞死亡所用的时间(最大寿命)。表达免疫细胞存活增强基因的免疫细胞比不表达免疫细胞存活增强基因的免疫细胞存活更长。测量这种作用的一种方式是将异源多核苷酸整合到免疫细胞的基因组中，其中异源多核苷酸包含与调控序列可操作地连接的免疫细胞存活增强基因，该调控序列使其在免疫细胞内表达，换言之，对于在免疫细胞中表达是有效的。异源多核苷酸还包含编码选择标记的基因，例如可以容易地鉴定的基因，如荧光蛋白或细胞表面蛋白。基因组包含异源多核苷酸的细胞表达免疫细胞存活增强基因，并且它们可以通过选择性标记的存在来识别。存活的增强可以测量为相对于不表达免疫细胞存活增强基因的免疫细胞，表达免疫细胞存活增强基因的免疫细胞的半衰期的增加。相对于不表达免疫细胞存活增强基因的免疫细胞的半衰期，表达免疫细胞存活增强基因的免疫细胞的半衰期增加至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少100％。这种增加可以通过比较具有和不具有存活增强基因的特定免疫细胞的相等大小群体的存活率来测量。相对于不表达免疫细胞存活增强基因的免疫细胞的最大寿命，表达免疫细胞存活增强基因的免疫细胞的最大寿命增加至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少100％。最大寿命的百分比变化可以通过比较具有和不具有存活增强基因的特定免疫细胞的相等大小的群体来测量。[0175]细胞增殖可以测量为群体中细胞数量加倍所需的时间长度(倍增时间)，或测量为单位时间长度内细胞群体增加的分数(增殖速率)。表达免疫细胞增殖增强基因的免疫细胞可以分裂更长时间，或者它们可以比不表达免疫细胞增殖增强基因的免疫细胞分裂得更快。测量这种作用的一种方式是将异源多核苷酸整合到免疫细胞的基因组中，其中异源多核苷酸包含与调控序列可操作地连接的免疫细胞增殖增强基因，该调控序列使其在免疫细胞内表达。异源多核苷酸还包含编码选择标记的基因，例如可以容易地鉴定的基因，如荧光蛋白或细胞表面蛋白。基因组包含异源多核苷酸的细胞表达免疫细胞增殖增强基因，并且它们可以通过选择性标记的存在来识别。增殖的增强可以测量为相对于不表达免疫细胞增殖增强基因的免疫细胞，表达免疫细胞增殖增强基因的免疫细胞的倍增时间的减少。相对于表达免疫细胞增殖增强基因的免疫细胞的倍增时间，不表达免疫细胞增殖增强基因的免疫细胞的倍增时间高出至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少100％。相对于不表达免疫细胞增殖增强基因的免疫细胞的增殖速率，表达免疫细胞增殖增强基因的免疫细胞的增殖速率增加加至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％、或至少75％、或至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少100％。增殖速率或倍增时间可以在免疫细胞已经开始表达免疫细胞增殖增强基因后的不同时间进行测量。在异源多核苷酸整合到免疫细胞的基因组中5天后、或10天后、或15天后、或20天后、或25天后后、或30天后、或35天后、或40天后、或45天后、或50天后、或55天后、或60天后、或在免疫细胞开始表达免疫细胞增殖增强基因后，表达免疫细胞增殖增强基因的免疫细胞的增殖速率可相对于不表达免疫细胞增殖增强基因的相同免疫细胞的增殖速率增加。[0176]本发明的另一个方面是公开了可用于增加免疫细胞在降低正常免疫细胞效力的条件下保持有效的时间长度的序列。正常t细胞在反复暴露于抗原时经历细胞凋亡(“再刺激-诱导的细胞死亡”)，并且那些没有死亡的细胞无法杀伤表达抗原的细胞(voss等人，2002)。(2017)cancerlett.408：190-196.“代谢重编程和细胞凋亡敏感性：定义t细胞应答的轮廓”)。尽管这有助于降低自身免疫性，但它是防止t细胞有效对抗实体瘤的影响因素。因此，在这些情况下，期望在重复抗原暴露期间保持免疫细胞功能并防止再刺激诱导的细胞死亡。再刺激诱导的细胞死亡可以通过计数暴露于抗原(例如肿瘤细胞上的抗原)2、3、4或更多次后存活的t细胞的数量来测量。当两个群体具有相同的抗原暴露程度和频率时，异源表达的序列防止再刺激诱导的细胞死亡的能力可以通过比较表达该序列的t细胞的存活与不表达该序列的t细胞的存活来测量。存活的增强可以测量为相对于重复暴露于抗原时不表达免疫细胞存活增强基因的免疫细胞，表达免疫细胞存活增强基因的剩余免疫细胞的数量的增加。相对于在重复暴露于例如在肿瘤细胞中表达的抗原时不表达免疫细胞存活增强基因的存活免疫细胞的数量，表达免疫细胞存活增强基因的存活免疫细胞的数量增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％、或至少250％、或至少300％、或至少350％、或至少400％、或至少450％、或至少500％。[0177]对再刺激诱导的细胞死亡的抗性和持续的免疫细胞效力可以通过计数t细胞在暴露于肿瘤细胞2、3、4或更多次后杀伤细胞如肿瘤细胞的能力来测量。当两个群体具有相同的抗原暴露程度和频率时，异源表达的序列维持免疫细胞功能的能力可以通过比较表达该序列的t细胞的细胞杀伤活性与不表达该序列的t细胞的细胞杀伤活性来测量。相对于重复暴露于肿瘤细胞时不表达t细胞效力增强基因的存活免疫细胞的数量，表达t细胞效力增强基因的t细胞的细胞杀伤活性增加至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％、或至少250％、或至少300％、或至少350％、或至少400％、或至少450％、或至少500％。[0178]6.2.1t细胞转化元件[0179]6.2.1.1突变stat3在原代t淋巴细胞中的表达[0180]将编码stat3的突变形式(stat3-y640f)的基因与序列如seqidno：115所示的pgk启动子和序列如seqidno：182所示的兔珠蛋白聚腺苷酸化信号可操作地连接，并克隆到基因转移多核苷酸中。该基因转移多核苷酸还包含gfp报告基因(序列如seqidno：222所示)，该gfp报告基因包含可操作地连接至甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)启动子和牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化信号序列的编码dashergfp的基因。两个开放阅读框被构建为发散转录(两个启动子彼此相邻并且以相反的方向转录)。两个开放阅读框的一侧侧翼为hs4绝缘子(序列如seqidno：92所示)，另一侧侧翼为d4z4绝缘子(序列如seqidno：88所示)。基因转移多核苷酸在一个绝缘子的远端还包含靶序列5'ttaa-3'，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：10(其为seqidno：6的一个实施方案)，紧接着是额外转座子末端序列seqidno：3(其与seqidno：1具有》95％同一性)。基因转移多核苷酸在另一绝缘子的远端还包含额外转座子末端序列seqidno：5(其与seqidno：4具有》95％的同一性)，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：11(其为seqidno：7的一个实施方案)，紧接着是靶序列5'ttaa-3'。[0181]使用来自stemcelltechnologies的easysephumancd8阳性选择试剂盒，根据制造商的说明书，利用来自正常供体的外周血单核细胞(pbmc)制备t细胞。通过与辐射的饲养细胞一起孵育来刺激t细胞2-3天，以提供分泌的cd3、cd28、il-2、il-7和il-15。根据制造商的说明书，使用neon电穿孔仪，用1μg转座子dna和100ng编码具有多肽序列seqidno：37的转座酶的mrna转染约100,000个t细胞。将转染的t细胞与饲养细胞混合并在37℃下孵育。在转染后的不同时间取样，用荧光标记的抗cd8抗体孵育，并在荧光激活细胞分选仪(facs)上分析cd8和dashergfp。[0182]图2显示了细胞染色随时间的分布。cd8染色用作cd8+t细胞的标记，并显示在图a中显示的每个facs图的y轴上。gfp荧光显示在每个facs图的x轴上；gfp荧光指示细胞正在表达gfp，并且本文也用作指示细胞内存在基因转移多核苷酸的标志物。在第14天，大约97.8％的细胞显示出强cd8染色(即它们位于facs图的上半部)，且大约9.8％的被分析细胞都是cd8+并显示gfp荧光。表达cd8并显示gfp荧光的细胞分数随时间增加：第28天增加23.9％，第34天增加41.1％，第41天增加62.4％，第48天增加79.3％。表达gfp的t细胞群体分数的增加表明基因组包含基因转移多核苷酸的t细胞与基因组不包含基因转移多核苷酸的t细胞相比具有存活优势，或者表明基因组包含基因转移多核苷酸的t细胞与基因组不包含基因转移多核苷酸的t细胞相比具有增殖优势。这种存活或增殖优势并非源于gfp的表达(我们看到了许多gfp表达与存活或增殖优势无关的实例)，而是源于stat3-y640f的表达。我们得出结论，stat3-y640f在t细胞中的表达为它们提供了存活或增殖优势，并且编码stat3的激活突变体的基因是如第5.3.1.1节中描述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。[0183]6.2.1.2原代t细胞中t细胞转化元件和esrs的表达[0184]将编码一组t细胞转化元件和增强型信号传导受体的基因单独克隆到单独的基因转移多核苷酸中。在每种情况下，将该基因与序列如seqidno：115所示的pgk启动子和序列如seqidno：182所示的兔珠蛋白多腺苷酸化信号可操作地连接，并克隆到基因转移多核苷酸中。该基因转移多核苷酸还包含gfp报告基因(序列如seqidno：222所示)，该gfp报告基因包含可操作地连接至甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)启动子和牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化信号序列的编码dashergfp的基因。两个开放阅读框被构建为发散转录(两个启动子彼此相邻并且以相反的方向转录)。两个开放阅读框的一侧侧翼为hs4绝缘子(序列如seqidno：92所示)，另一侧侧翼为d4z4绝缘子(序列如seqidno：88所示)。基因转移多核苷酸在一个绝缘子的远端还包含靶序列5'ttaa-3'，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：10(其为seqidno：6的一个实施方案)，紧接着是额外转座子末端序列seqidno：3(其与seqidno：1具有》95％同一性)。基因转移多核苷酸在另一绝缘子的远端还包含额外转座子末端序列seqidno：5(其与seqidno：4具有》95％的同一性)，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：11(其为seqidno：7的一个实施方案)，紧接着是靶序列5'ttaa-3'。[0185]使用来自stemcelltechnologies的easysephumancd8阳性选择试剂盒，根据制造商的说明书，利用来自正常供体的外周血单核细胞(pbmc)制备t细胞。通过与辐射的饲养细胞一起孵育来刺激t细胞2-3天，以提供分泌的cd3、cd28、il-2、il-7和il-15。根据制造商的说明书步骤，使用neon电穿孔仪，用1μg转座子dna和100ng编码具有多肽序列seqidno：37的转座酶的mrna转染约100,000个t细胞。将转染的t细胞与饲养细胞混合并在37℃下孵育。在转染后的24天取样，用荧光标记的抗cd8抗体孵育，并在荧光激活细胞分选仪(facs)上分析cd8和dashergfp。数据示于表5中。[0186]如6.2.1.1节所述，表达gfp的cd8+细胞的富集是基因转移多核苷酸包含赋予t细胞存活或增殖优势的基因的指示物，也如5.3.1.1节所述。在这组基因转移多核苷酸中，cd19作为细胞表面标志物被包括在内，预计对t细胞存活没有影响，因此我们使用了在用cd19转染的细胞中表达gfp的细胞的百分比(3％，参见表5第10行)作为对推定的存活增强基因进行基准测试的水平。用具有两个激活突变d124e和t195p的编码cd28的基因转染的t细胞比用cd19转染的细胞多10倍以上的表达gfp的细胞(表5第1行)。编码识别与cd3e或cd3d融合的表皮生长因子受体(egfr)的抗体片段的基因似乎使表达gfp细胞的百分比比cd19增加4倍(分别为表5的第2行和第3行)，尽管我们注意到cd3d融合的第二次测量显示gfp表达的百分比低得多(表5的第15行)。与cd19相比，天然生存素基因似乎使gfp表达增加3倍(表5第4和5行)。还示出了两个esrs。首先，包含与cd28跨膜结构域(序列如seqidno：395所示)和包含t195p激活突变的cd28胞内结构域(序列如seqidno：352所示)融合的抗cd28抗体(序列如seqidno：340所示)导致表达gfp的细胞的数量增加约2倍(表5第6行和第7行)。包含tnfrsf1a胞外结构域(序列如seqidno：330所示)和跨膜结构域(序列如seqidno：394所示)以及4-1bb胞内结构域(序列如seqidno：344所示)的第二esr导致表达gfp的细胞的数量增加略小于2倍(表5第8行和第9行)。两种共转染在增加表达gfp的细胞的百分比方面尤其有活性。表5第16行所示的一种共转染包括编码esr(也描述于5.3.2.1节)的第一基因，该esr包括fas受体的胞外结构域和跨膜结构域(tnfrsf6)(序列分别如seqidno：323和387所示)和4-1bb的胞内结构域(tnfrsf9)(序列如seqidno：344所示)，以及编码半胱天冬酶7的显性失活突变体的第二基因(序列如seqidno：262所示)表5第17行所示的第二种共转染包含编码sta3-y640f的第一基因(序列如seqidno：246所示)和编码pik3ca-l1001p的第二基因(序列如seqidno：257所示)。24天后，这些共转染分别产生51％和46％的表达gfp的细胞。[0187]我们得出结论：t细胞中cd28-d124e-t195p的表达、或esrfas/4-1bb和casp7-dn的共同表达，或stat3-y640f和pik3ca-l1001p共同表达为它们提供了存活或增殖优势，并且这些基因或基因组合是如第5.3.1.1节中所述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。[0188]6.2.1.3生存素和cd28的激活突变体增强t细胞功能[0189]如6.2.1.2节和表5所示，我们发现生存素或d124e/t195p激活的cd28双突变体的表达增强了t细胞生长/存活和/或增殖。为了测试这些基因是否也可以增强t细胞性能，我们将它们与靶向cd19的嵌合抗原受体(仅在b细胞上天然发现的表位)一起整合到t细胞的基因组中，并测试了经修饰的t细胞杀伤转化的b细胞系的细胞的能力。[0190]构建了三种基因转移多核苷酸：各自包含gfp报告基因(序列seqidno：222)，该gfp报告基因包含可操作地连接甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)启动子和牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化信号序列的编码dashergfp的基因。gfp基因的一侧侧翼为hs4绝缘子(序列seqidno：92)，另一侧侧翼为d4z4绝缘子(序列seqidno：88)。基因转移多核苷酸在一个绝缘子的远端还包含靶序列5'ttaa-3'，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：10(其为seqidno：6的一个实施方案)，紧接着是日seqidno：3(其与seqidno：1具有》95％同一性)所示的额外转座子末端序列。基因转移多核苷酸在另一绝缘子的远端还包含如seqidno：5(其与seqidno：4具有》95％的同一性)所示的额外转座子末端序列，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：11(其为seqidno：7的一个实施方案)，紧接着是靶序列5'ttaa-3'。该基因转移多核苷酸还包含编码cd10结合嵌合抗原受体(序列如seqidno：229所示的多肽)的基因，其可操作地连接至pgk启动子或gapdh启动子：如6.1.2节所述和表3所示，在t细胞中显示相当活性的启动子。嵌合抗原受体基因存在于基因转移多核苷酸中，使得其与所述dashergfp基因分散地转录，并且使其处于可被转座酶转座的部分基因转移多核苷酸中。第一基因转移多核苷酸(346463，序列如seqidno：225所示)不包含另外的转座基因。第二基因转移多核苷酸(346776，序列如seqidno：226所示)还包含可操作地连接至pgk启动子的编码生存素的开放阅读框，以与嵌合抗原受体相同的方向转录，并且也可在由转座酶转座的部分基因转移多核苷酸中转录。第三基因转移多核苷酸(346777，序列如seqidno：227所示)包含嵌合抗原受体并且还包含可操作地连接至pgk启动子的编码cd28-d124e-t195p的开放阅读框，以与嵌合抗原受体相同的方向转录，并且也可在由转座酶转座的部分基因转移多核苷酸中转录。[0191]6.2.1.3a生存素和激活的cd28增强的离体car细胞杀伤测试1[0192]使用来自stemcelltechnologies的easysephumancd8阳性选择试剂盒，根据制造商的说明书，利用来自2个不同的正常供体的外周血单核细胞(pbmc)制备t细胞。通过与辐射的饲养细胞一起孵育来刺激t细胞2-3天，以提供分泌的cd3、cd28、il-2、il-7和il-15。根据制造商的说明书步骤，使用neon电穿孔仪，用1μg转座子dna和100ng编码如seqidno：37所示的转座酶的mrna转染约200,000个t细胞。将转染的t细胞与饲养细胞混合并在37℃下孵育。细胞在培养物中生长约5周，此时约10％的用每种基因转移多核苷酸转染的细胞表达gfp。然后将t细胞样品(200,000)与等量的jy细胞混合：jy是epstein-barr病毒永生化b细胞淋巴母细胞样细胞系，其表达cd19并因此是抗cd19嵌合抗原受体的靶标。用抗cd8和抗cd19抗体对混合3天和7天后从细胞混合物中取出细胞样品进行染色(以分别标记t细胞和jy细胞)。结果如图3和表6所示。混合后第3天，仅表达嵌合抗原受体的t细胞基本上消失，被jy肿瘤细胞淹没：仅8％的可检测细胞表达cd8，而89％表达cd19(图3图a，表6的a列第3行和第4行)。混合后7天，仅2.3％的细胞是表达cd8的t细胞(图3的图d，表6的a列第5行和第6行)。相反，表达嵌合受体和生存素或cd28-d124e-t195p的t细胞能够在jy肿瘤细胞存在下存活。如图3的图b和c以及表6的b和c列、第3和4行所示，3天后，40-50％的细胞表达cd8(t细胞标志物)，仅23-29％表达cd19(肿瘤细胞标志物)。到第7天，肿瘤细胞已经被有效地清除，所有细胞中大约90％表达cd8(图3的图e和f以及表6的b和c列、第5和6行)。我们的结论是，生存素或cd28的d124e/t195p激活的双突变体的表达不仅增强t细胞的生长/存活和/或增殖，它们还可以通过使t细胞在肿瘤细胞存在下存活并保持活性以杀伤肿瘤细胞来增强t细胞性能。[0193]6.2.1.3b生存素和激活的cd28增强的离体car细胞杀伤[0194]使用facs分选转染的t细胞的第二份样品以选择表达gfp的细胞(其为转座子在t细胞基因组中存在的指示物)。将所选择的细胞在培养物中再生长一周并测试其在体内杀伤jy肿瘤细胞的能力。通过腹腔注射向nsg免疫功能低下的小鼠施用100万个jy细胞。7天后，通过腹腔注射向jy处理的小鼠施用100万个表达gfp的t细胞。两只小鼠接受磷酸盐缓冲盐水(pbs)代替t细胞的非活性对照处理。如表7所示，接受pbs的小鼠在jy细胞注射后存活了24或25天(表7第1行和第2行)。施用表达嵌合抗原受体的t细胞可将jy注射后的存活期延长5-6天至30天(表7第3行)。施用表达嵌合抗原受体和生存素或cd28-d124e-t195p的t细胞可将jy注射后的存活期延长另外4天至34天(表7第4和5行)。我们的结论是，生存素或cd28的d124e/t195p激活的双突变体的表达不仅增强t细胞的离体生长/存活和/或增殖，它们还可以通过使t细胞在肿瘤细胞存在下存活并保持活性以杀伤肿瘤细胞来增强体内的t细胞性能。[0195]6.2.1.3c生存素和激活的cd28增强的离体car细胞杀伤测试2[0196]我们还对仅表达抗cd19嵌合抗原受体或与生存素或cd28-d124e-t195p共表达的嵌合抗原受体的t细胞进行了肿瘤再激发测试(tumorre-challengetest)。由于相对较短的共培养时间和较高的t细胞与肿瘤的比率，标准的单激发离体肿瘤裂解试验(standardsinglechallengeex-vivotumor-lysisassay)通常高估了t细胞的真正抗肿瘤潜力。为了确定存活增强基因(在这种情况下是生存素和cd28-d124e-t195p)是否也可以增强t细胞功能，我们使用了递归高肿瘤细胞负荷激发以更好地模拟周围的肿瘤微环境来激发t细胞的存活。在总体积为200μl的微滴定板孔中，用1、2、3、4或5个连续剂量的100,000nalm6(其为cd19+、cd20-、cd21-)细胞激发t细胞(100,000)。每100,000个细胞nalm6剂量间隔48小时。对于每次再激发，取出100μl的上清液，并且添加100μl的含有100,000个nalm6细胞的新鲜培养基。在对样品的最后一次激发后24小时，通过添加d荧光素并使用bioteksynergyneo2混合酶标仪根据制造商的说明书测量发光，将nalm6细胞死亡测量为生物发光的减少(参见例如karimiet.al.,(2014)“通过生物发光成像测量细胞毒性优于标准铬-51释放测定”plosone9(2)：e89357)。[0197]将用转座子转染的细胞离体培养10个月，该转座子包含抗cd19car和任选的编码生存素的基因或编码cd28中激活突变的基因，如6.2.1.3a节所述。此时细胞表达了》95％的gfp(并且推断也表达了car，如果存在，还表达了存活增强基因)。t细胞在离体培养中存活10个月是不寻常的。对于表达存活基因的t细胞，我们将这种长寿归因于生存素或cd28-d124e-t195p的表达。然而，我们还观察到仅表达嵌合抗原受体的t细胞的这种长期存活，尽管它们比也表达存活基因的细胞生长得更慢。当编码嵌合抗原受体的基因与pgk启动子或gapdh启动子或驱动相当表达水平的启动子可操作地连接时，我们将这归因于最佳car水平的表达。在长期离体培养损害了t细胞杀伤肿瘤细胞的能力的情况下，我们将6.2.1.3a节中描述的转染重复到来自不同供体的t细胞中，并将细胞离体培养4个月，然后用肿瘤再激发试验测试它们。nalm6细胞死亡结果示于表8中。[0198]表8第1行显示了t细胞用nalm6细胞激发的次数。表8第2-4行显示了离体生长10个月的表达抗cd19嵌合抗原受体的t细胞群对nalm6的杀伤作用。t细胞也表达生存素(第3行)或cd28-d124e-t195p(第4行)。仅表达嵌合抗原受体的细胞在第一次激发时杀伤了100％的nalm6细胞，但在随后的激发时杀伤效率下降：第二次激发后85％、第三次激发后47％、第四次激发后23％以及第五次激发后仅10％的nalm6细胞被杀伤(参见表8第2行)。相比之下，也表达生存素的细胞能够在第五次激发时杀伤76％的nalm6细胞(表8第3行)，并且也表达cd28-d124e-t195p的细胞能够在第五次激发时杀伤82％的nalm6细胞(表8第4行)。在仅离体培养4个月的细胞中观察到相似的杀伤模式，尽管杀伤效率通常更高(表8第5-7行)。仅表达嵌合抗原受体的细胞在第一次和第二次激发时杀伤100％的nalm6细胞，但在随后的激发时杀伤效率下降：在第三次激发后51％、在第四次激发后28％以及在第五次激发后27％的nalm6细胞被杀伤(参见表8第5行)。相比之下，也表达生存素的细胞能够在第五次激发时杀伤90％的nalm6细胞(表8第6行)，并且也表达cd28-d124e-t195p的细胞能够在第五次激发时杀伤91％的nalm6细胞(表8第7行)。[0199]这表明表达嵌合抗原受体的t细胞对生存素或cd28-d124e-t195p的表达增强了这些细胞对靶细胞杀伤并降低了细胞耗尽的速率。用于杀伤肿瘤细胞的有利t细胞包含异源多核苷酸，该异源多核苷酸包含可表达的生存素或cd28-d124e-t195p基因。[0200]6.2.1.4原代t细胞中bcl2和bcl6的表达[0201]由病毒chysl(2a)序列分离的编码bcl2和bcl6的开放阅读框(完整开放阅读框bcl2-2a-bcl6的序列如seqidno：272所示)与序列如seqidno：115所示的pgk启动子和序列如seqidno：182所示的兔珠蛋白聚腺苷酸化信号可操作地连接，并克隆到基因转移多核苷酸中。该基因转移多核苷酸还包含gfp报告基因(序列seqidno：222)，该gfp报告基因包含可操作地连接至甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)启动子和牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化信号序列的编码dashergfp的基因。两个开放阅读框被构建为发散转录(即，两个启动子彼此相邻并且以相反的方向转录)。两个开放阅读框的一侧侧翼为hs4绝缘子(序列seqidno：92)，另一侧侧翼为d4z4绝缘子(序列seqidno：88)。基因转移多核苷酸在一个绝缘子的远端还包含靶序列5'ttaa-3'，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：10(其为seqidno：6的一个实施方案)，紧接着是如seqidno：3(其与seqidno：1具有》95％同一性)所示的额外转座子末端序列。基因转移多核苷酸在另一绝缘子的远端还包含如seqidno：5(其与seqidno：4具有》95％的同一性)所示的额外转座子末端序列，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：11(其为seqidno：7的一个实施方案)，紧接着是靶序列5'ttaa-3'。[0202]使用来自stemcelltechnologies的easysephumancd8阳性选择试剂盒，根据制造商的说明书，利用来自正常供体的外周血单核细胞(pbmc)制备t细胞。通过与辐射的饲养细胞一起孵育来刺激t细胞2-3天，以提供分泌的cd3、cd28、il-2、il-7和il-15。根据制造商的说明书步骤，使用neon电穿孔仪，用1μg转座子dna和100ng编码序列如seqidno：37所示的转座酶的mrna转染约100,000个t细胞。将转染的t细胞与饲养细胞混合并在37℃下孵育。在转染后的不同时间取样，用荧光标记的抗cd8抗体孵育，并在荧光激活细胞分选仪(facs)上分析cd8和dashergfp。[0203]图4显示了细胞染色随时间的分布。cd8染色用作cd8+t细胞的标记，并显示在图a中显示的每个facs图的y轴上。gfp荧光显示在每个facs图的x轴上；gfp荧光指示细胞正在表达gfp，它在本文中也用作指示细胞内存在基因转移多核苷酸的标志物。图b是显示也表达gfp的表达cd8的t细胞的百分比的图。在转染后第一天，约26％的表达cd8的细胞也表达gfp。到第10天，88.7％的细胞显示强的cd8染色但没有gfp表达，11.3％的表达cd8的细胞也表达gfp，表明它们也含有基因转移多核苷酸。也表现出gfp荧光的表达cd8细胞分数随着时间的推移而增加：在第19天增加29.4％，在第42天增加80％。表达gfp的t细胞群体分数的增加表明基因组包含基因转移多核苷酸的t细胞与基因组不包含基因转移多核苷酸的t细胞相比具有存活优势，或者表明基因组包含基因转移多核苷酸的t细胞与基因组不包含基因转移多核苷酸的t细胞相比具有增殖优势。我们得出结论，bcl2和bcl6在t细胞中的表达为它们提供了存活或增殖优势，并且编码bcl2和bcl6的基因是如第5.3.1.1节所述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。[0204]6.2.1.5原代t细胞中t细胞转化元件和esrs的表达[0205]将编码一组t细胞转化元件和增强型信号传导受体的基因单独克隆到单独的基因转移多核苷酸中。在每种情况下，将该基因与序列如seqidno：115所示的pgk启动子和序列如seqidno：182所示的兔珠蛋白多腺苷酸化信号可操作地连接。该基因转移多核苷酸还包含gfp报告基因(序列seqidno：222)，该gfp报告基因包含可操作地连接至甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)启动子和牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化信号序列的编码dashergfp的基因。两个开放阅读框被构建为发散转录(即，两个启动子彼此相邻并且以相反的方向转录)。两个开放阅读框的一侧侧翼为hs4绝缘子(序列seqidno：92)，另一侧侧翼为d4z4绝缘子(序列seqidno：88)。基因转移多核苷酸在一个绝缘子的远端还包含靶序列5'ttaa-3'，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：10(其为seqidno：6的一个实施方案)，紧接着是额外转座子末端序列seqidno：3(其与seqidno：1具有》95％同一性)。基因转移多核苷酸在另一绝缘子的远端还包含额外转座子末端序列seqidno：5(其与seqidno：4具有》95％的同一性)，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：11(其为seqidno：7的一个实施方案)，紧接着是靶序列5'ttaa-3'。[0206]使用来自stemcelltechnologies的easysephumancd8阳性选择试剂盒，根据制造商的说明书，利用来自2个供体的外周血单核细胞(pbmc)制备t细胞。通过与辐射的饲养细胞一起孵育来刺激t细胞2-3天，以提供分泌的cd3、cd28、il-2、il-7和il-15。根据制造商的说明书，使用neon电穿孔仪，用1μg转座子dna和100ng编码序列如seqidno：37所示的转座酶的mrna转染约100,000个t细胞。将转染的t细胞与饲养细胞混合并在37℃下孵育。在转染后的不同时间取样，用荧光标记的抗cd8抗体孵育，并在荧光激活细胞分选仪(facs)上分析cd8和dashergfp。数据示于表9中。[0207]如6.2.1.1节所述，表达gfp的cd8+细胞的富集是基因转移多核苷酸包含赋予t细胞存活或增殖优势的基因的指示物，如5.3.1.1节所述。在这组基因转移多核苷酸中，hsv-tk作为对照基因被包括在内，预计对t细胞存活没有影响。因此，因此我们使用了在用hsv-tk转染的细胞中表达gfp的细胞的百分比作为对推定的存活增强基因进行基准测试的水平。如表9中所见，来自2个供体的t细胞的两次独立转染在7.5％至15.3％的细胞(表9第7行和第8行)中产生初始gfp表达(指示转染效率)。到第14天，这些百分比显著下降，并且在随后的时间，表达gfp的细胞的百分比保持大致稳定或下降。这表明，正如所预期的，hsv-tk不提供具有生长或增殖优势的t细胞。相比之下，包含编码stat3突变体(stat3-d661y和stat3-s614r-y640f)的基因的两种测试基因转移多核苷酸显示在2个供体中表达gfp的细胞百分比逐渐增加(表9第1行和第3行)，表明这些基因确实为t细胞提供了生长或增殖优势，类似于6.2.1.1节中针对sta3-y640f看到的优势。我们得出结论，包括stat3-d661y和sta3-s614r-y640f的激活stat3突变体在t细胞中的表达为它们提供了存活或增殖优势，并且编码stat3的激活突变体的基因是如5.3.1.1节中描述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。[0208]测试的基因转移多核苷酸之一包含编码凋亡抑制因子bcl-xl的基因。这些细胞在2个供体中表达gfp的细胞的百分比逐渐增加(表9第2行)，表明bcl-xl的表达提供具有生长或增殖优势的t细胞，并且编码bcl-xl的基因是如5.3.1.1节中所述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。[0209]测试的基因转移多核苷酸之一包含编码磷脂酶c激活突变(plcg1-s345f)的基因。这些细胞在2个供体中表达gfp的细胞的百分比增加(表9第6行)，表明plcg1-s345f的表达为t细胞提供了生长或增殖优势，并且编码plcg1-s345f的基因是如5.3.1.1节中所述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。[0210]在该实验中还测试了两种esrs。一种tnfr1/cd27(序列如seqidno：301所示)包含来自tnfrsf1a的胞外结构域(序列如seqidno：330所示)、来自tnfrsf1a的跨膜结构域(序列如seqidno：394所示)和来自cd27的胞内结构域(序列如seqidno：343所示)。第二种tnfr1/4-1bb(序列如seqidno：302所示)也包含来自tnfrsf1a的胞外结构域(序列如seqidno：330所示)和来自tnfrsf1a的跨膜结构域(序列如seqidno：394所示)，在这种情况下与来自4-1bb的胞内结构域(序列如seqidno：344所示)融合。esrtnfr1/cd27和esrtnfr1/4-1bb在其中一个供体中均导致高百分比的表达gfp的细胞(表9第4行)，表明esrtnfr1/cd27或esrtnfr1/4-1bb的表达可以为t细胞提供生长或增殖优势，并且编码esrtnfr1/cd27或esrtnfr1/4-1bb的基因是如5.3.1.1节中所述的免疫细胞存活增强基因和免疫细胞增殖增强基因。[0211]6.2.1.6bcl-xl对原代t细胞杀伤肿瘤细胞的影响[0212]6.2.1.6abcl-xl增强的离体bite细胞杀伤测试[0213]将编码bcl-xl(多肽序列如seqidno：238所示)的基因克隆到基因转移多核苷酸中。将该基因与序列如seqidno：115所示的pgk启动子和序列如seqidno：182所示的兔珠蛋白多腺苷酸化信号可操作地连接。该基因转移多核苷酸还包含gfp报告基因(序列seqidno：222)，该gfp报告基因包含可操作地连接至甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)启动子和牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化信号序列的编码dashergfp的基因。两个开放阅读框被构建为发散转录(即，两个启动子彼此相邻并且以相反的方向转录)。两个开放阅读框的一侧侧翼为hs4绝缘子(序列如seqidno：92所示)，另一侧侧翼为d4z4绝缘子(序列如seqidno：88所示)。基因转移多核苷酸在一个绝缘子的远端还包含靶序列5'ttaa-3'，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：10(其为seqidno：6的一个实施方案)，紧接着是额外转座子末端序列seqidno：3(其与seqidno：1具有》95％同一性)。基因转移多核苷酸在另一绝缘子的远端还包含额外转座子末端序列seqidno：5(其与seqidno：4具有》95％的同一性)，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：11(其为seqidno：7的一个实施方案)，紧接着是靶序列5'ttaa-3'。[0214]使用来自stemcelltechnologies的easysephumancd8阳性选择试剂盒，根据制造商的说明书，利用来自3个供体的外周血单核细胞(pbmc)制备t细胞。通过与辐射的饲养细胞一起孵育来刺激t细胞2-3天，以提供分泌的cd3、cd28、il-2、il-7和il-15。根据制造商的说明书步骤，使用neon电穿孔仪，用1μg转座子dna和100ng编码序列如seqidno：37所示的转座酶的mrna转染约100,000个t细胞。将转染的t细胞与饲养细胞混合并在37℃下孵育。[0215]细胞在t细胞培养基中培养生长240天。如6.2.1.6节和表9中所述，bcl-xl为t细胞提供了选择优势。我们能够培养这些细胞8个月证明了bcl-xl基因在t细胞中的表达增强了它们的离体存活。除了存活之外，我们测试了这些t细胞是否通过将它们与肿瘤细胞系混合而保留了它们的细胞毒性。在测试细胞毒性之前，我们通过测量gfp来确定表达bcl_xl的细胞分数，gfp由整合到bcl_xl细胞基因组中的相同转座子表达。图5显示了转染后240天来自3个不同供体的t细胞的流式细胞分析，x轴上为gfp，y轴上为t细胞标志物cd8的染色。图a显示了超过90％的来自供体81的t细胞表达gfp，图b显示了超过99％的来自供体82的t细胞表达gfp，图c显示了超过98％的来自供体84的t细胞表达gfp。因此在240天后，来自每个供体的绝大多数t细胞表达gfp，并且根据推断bcl-xl。[0216]为了测量细胞毒性，我们将100,000个t细胞与的100,000个b细胞肿瘤系nalm6(其为cd19+、cd20-、cd21-)细胞混合，nalm6含有基因组整合的编码荧光素酶的基因。在一些反应中包括具有针对cd3(在t细胞表面上)和cd19(在nalm6表面上)的结合结构域的双特异性t细胞衔接器(bite)，以将t细胞带到肿瘤靶细胞。第二天，我们使用生物发光测定法((参见例如karimiet.al.,(2014)“通过生物发光成像测量细胞毒性优于标准铬-51释放测定”plosone9(2)：e89357)以测定已经裂解的nalm6细胞分数。[0217]细胞毒性测试作为肿瘤再激发进行。由于相对较短的共培养时间和较高的t细胞与肿瘤的比率，标准的单激发离体肿瘤裂解试验通常高估了t细胞的真正抗肿瘤潜力。为了确定存活增强基因(在这种情况下为bcl-xl)是否也可以增强t细胞功能，我们使用了递归高肿瘤细胞负荷激发以更好地模拟周围的肿瘤微环境来激发t细胞的存活。在总体积为200μl的微滴定板孔中，用1、2、3、4或5个连续剂量的100,000nalm6细胞激发t细胞(100,000)。每100,000个细胞nalm6剂量间隔48小时。对于每次再激发，取出100μl的上清液，并且添加100μl的含有100,000个nalm6细胞的新鲜培养基。在对样品的最后一次激发后24小时，通过加入d荧光素并根据制造商的说明书使用bioteksynergyneo2混合酶标仪测量发光，以生物发光的减少来测量nalm6细胞死亡。nalm6细胞死亡结果示于表10中。[0218]表10第1行显示了t细胞用nalm6细胞激发的次数。表10第2-5行显示了在不存在任何bite的情况下四种不同的t细胞群对nalm6的杀伤作用。在这些条件下的细胞杀伤反映了一般的异源杀伤，没有针对肿瘤抗原的特异性靶向。表达bcl-xl的3个t细胞群体所实现的杀伤(表10，第2-4行)与初始t细胞(t-cell)所实现的杀伤(表10第5行)非常相当。值得注意的是，与已培养8个月的表达bcl-xl的t细胞相比，初始t细胞在用于本实验之前仅培养了几周。这表明bcl-xl表达可以使t细胞在培养物中生长8个月，同时保持它们的细胞毒性。[0219]在存在靶向nalm6细胞表面上的cd19抗原的bite的情况下进行第二组激发。表10第9行显示了在存在bite的情况下初始t细胞对nalm6的杀伤作用。在第一次和第二次激发后的杀伤比没有bite的更有效：在第一次激发时88％的nalm6细胞被杀伤，并且在第二次激发后97％被杀伤。然后杀伤效率降低：在第三次激发后72％的nalm6细胞被杀伤，在第四次激发后62％被杀伤，第五次激发后59％被杀伤。这种降低是长期肿瘤再激发后观察到的t细胞效力丧失的标志(参见例如voss等人，(2017)cancerlett.408：190-196.“代谢重编程和细胞凋亡敏感性：定义t细胞应答的轮廓”)。表达bcl-xl的3个t细胞群在bite存在下进行1或2次激发后在杀伤nalm6方面与初始t细胞一样有效(表10第6-8行)。与天然t细胞不同，表达bcl-xl的t细胞的nalm6杀伤效率在连续激发后没有降低。在第五次激发后，与初始t细胞59％的杀伤效率相比，表达bcl-xl的t细胞群体(来自供体81和84)中的两个杀伤95％的nalm6细胞(表10第6行和第8行)，并且第三群体(来自供体82)杀伤94％的nalm6细胞(表10第7行)。这表明，不仅离体生长了8个月的表达bcl-xl的t细胞仍然能够像仅培养几周的初始t细胞一样杀伤肿瘤细胞；而且在反复暴露于肿瘤抗原后，它们似乎对降低t细胞效力的因素较不敏感。[0220]6.2.1.6bbcl-xl增强的离体car细胞杀伤测试[0221]如6.2.1.3c节所述，我们对表达抗cd19嵌合抗原受体的t细胞进行了肿瘤再激发测试。转座子如6.2.1.3节中所述，包含与生存素或cd28-d124e-t195p共表达的嵌合抗原受体，并且制备了包含与bcl-xl共表达的嵌合抗原受体的另外的转座子。为了确定存活增强基因(在这种情况下是生存素、cd28-d124e-t195p和bcl-xl)是否也可以增强t细胞功能，我们使用了递归高肿瘤细胞负荷激发以更好地模拟周围的肿瘤微环境来激发t细胞的存活。在总体积为200μl的微滴定板孔中，用1、2、3、4、5或6个连续剂量的100,000nalm6(其为cd19+、cd20-、cd21-)细胞激发t细胞(100,000)。每100,000个细胞nalm6剂量间隔48小时。对于每次再激发，取出100μl的上清液，并且添加100μl的含有100,000个nalm6细胞的新鲜培养基。在对样品的最后一次激发后24小时，通过添加d荧光素并使用bioteksynergyneo2混合酶标仪根据制造商的说明书测量发光，将nalm6细胞死亡测量为生物发光的减少(参见例如karimiet.al.,(2014)“通过生物发光成像测量细胞毒性优于标准铬-51释放测定”plosone9(2)：e89357)。[0222]将用转座子转染的细胞离体培养4个月，该转座子包含抗cd19car和任选地编码生存素的基因或编码cd28中激活突变的基因或编码bcl-xl的基因。此时细胞表达了》95％的gfp(并且推断也表达了car，如果存在，还表达了存活增强基因)。nalm6细胞死亡结果示于表11中。[0223]表11第1行显示了t细胞用nalm6细胞激发的次数。表11第2行显示了表达抗cd19嵌合抗原受体的t细胞群体对nalm6的杀伤作用。t细胞也表达生存素(第3行)、cd28-d124e-t195p(第4行)或bcl-xl(第5行)。没有嵌合抗原受体的细胞显示在第6行。仅表达嵌合抗原受体的细胞在第一次激发时杀伤70％的nalm6细胞，在第二次激发时杀伤效率上升至97％，但随后在后续激发时再次下降：第三次激发后69％、第四次激发后59％、第五次激发后58％以及第六次激发后53％的nalm6细胞被杀伤(参见表11第2行)。相比之下，也表达生存素的细胞能够在第六次激发时杀伤85％的nalm6细胞(表11第3行)；也表达cd28-d124e-t195p的细胞能够在第六次激发时杀伤85％的nalm6细胞(表11第4行)，并且也表达bcl-xl的细胞能够在第六激发时杀伤94％的nalm6细胞(表11第5行)。这表明通过表达嵌合抗原受体的t细胞对生存素或cd28-d124e-t195p或bcl-xl的表达增强了这些细胞的靶细胞杀伤并降低了细胞变得不能杀伤肿瘤细胞的速率。用于杀伤肿瘤细胞的有利t细胞包含编码嵌合抗原受体的基因和包含可表达的生存素或cd28-d124e-t195p或bcl-x基因的异源多核苷酸。[0224]本文的凋亡抑制因子生存素、bcl-xl、bcl2和bcl6均显示作为免疫细胞存活基因。预期半胱天冬酶通路中的显性失活基因，例如半胱天冬酶3、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10或casp8和fadd样凋亡调节剂(cflar)具有类似作用。在本发明的一些实施方案中，免疫细胞包含编码凋亡通路的显性失活抑制因子的基因，该抑制因子包含选自seqidno：240-245的序列的显性失活突变体；在一些实施方案中，凋亡通路的抑制因子包含选自seqidno：237、238或261-272的序列。[0225]6.2.2增强型信号传导受体[0226]6.2.2.1抗cd28/ox40是具有增殖增强活性的esr[0227]设计一种基因以编码抗cd28/ox40esr(序列如seqidno：307所示)，其包含与tnfrsf4(ox40)的跨膜结构域(序列如seqidno：373所示)和tnfrsf4(ox40)的胞内结构域(序列如seqidno：341所示)融合的抗cd28抗体tgn1412(序列如seqidno：340所示)。将该基因与序列如seqidno：115所示的pgk启动子和如seqidno：182所示的兔珠蛋白多腺苷酸化信号序列可操作地连接。该基因转移多核苷酸还包含gfp报告基因(序列如seqidno：222所示)，该gfp报告基因包含可操作地连接至甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)启动子和牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化信号序列的编码dashergfp的基因。两个开放阅读框被构建为发散转录(两个启动子彼此相邻并且以相反的方向转录)。两个开放阅读框的一侧侧翼为hs4绝缘子(序列如seqidno：92所示)，另一侧侧翼为d4z4绝缘子(序列如seqidno：88所示)。基因转移多核苷酸在一个绝缘子的远端还包含靶序列5'ttaa-3'，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：10(其为seqidno：6的一个实施方案)，紧接着是额外转座子末端序列seqidno：3(其与seqidno：1具有》95％同一性)。基因转移多核苷酸在另一绝缘子的远端还包含额外转座子末端序列seqidno：5(其与seqidno：4具有》95％的同一性)，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：11(其为seqidno：7的一个实施方案)，紧接着是靶序列5'ttaa-3'。[0228]使用来自stemcelltechnologies的easysephumancd8阳性选择试剂盒，根据制造商的说明书，利用来自2个不同的正常供体的外周血单核细胞(pbmc)制备t细胞。通过与辐射的饲养细胞一起孵育来刺激t细胞2-3天，以提供分泌的cd3、cd28、il-2、il-7和il-15。根据制造商的说明书步骤，使用neon电穿孔仪，用1μg转座子dna和100ng编码序列如seqidno：37所示的转座酶的mrna转染约100,000个t细胞。将转染的t细胞与饲养细胞混合并在37℃下孵育。在转染后的1、14和28天取样，用荧光标记的抗cd8抗体孵育，并在荧光激活细胞分选仪(facs)上分析cd8和dashergfp。数据示于表12中。[0229]如6.2.1.1节所述，表达gfp的cd8+细胞的富集是基因转移多核苷酸包含赋予t细胞存活或增殖优势的基因的指示物，如5.3.1.1节所述。用抗cd28/ox40esr基因转染的t细胞显示出极快的gfp积累。在来自一个供体的细胞中，94％的cd8+细胞在14天内为gfp+。在来自第二供体的细胞中，98％的细胞在28天内为gfp+。与用对照基因转染的细胞相比，hsv-tk显示相当的初始(第1天)gfp水平，但这些水平降低而不是gfp表达细胞变得富集。该数据表明抗cd28/ox40esr的表达为表达esr的t细胞提供了非常显著的生长/增殖优势。[0230]6.2.2.2esrfas/4-1bb在casp7-dn存在下刺激增殖[0231]设计一种基因以编码esr，其包含tnfrsf6(fas)的胞外结构域(序列如seqidno：323所示)，并且还包含tnfrsf6(fas)的跨膜结构域(序列如seqidno：387所示)，并且还包含tnfrsf9(4-1bb)的胞内结构域(序列如seqidno：344所示)。该esr(fas/4-1bb)包含序列seqidno：274。还设计了编码凋亡抑制因子的第二个基因casp7的显性失活形式：casp7-dn(序列如seqidno：262所示)。[0232]将esr和casp7-dn分别克隆到基于转座子的基因转移载体中。每个基因与序列如seqidno：115所示的pgk启动子和序列如seqidno：182所示的兔珠蛋白多腺苷酸化信号序列可操作地连接。每个基因转移多核苷酸还包含gfp报告基因(序列如seqidno：222所示)，该gfp报告基因包含可操作地连接至甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)启动子和牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化信号序列的编码dashergfp的基因。两个开放阅读框被构建为发散转录(两个启动子彼此相邻并且以相反的方向转录)。两个开放阅读框的一侧侧翼为hs4绝缘子(序列如seqidno：92所示)，另一侧侧翼为d4z4绝缘子(序列如seqidno：88所示)。基因转移多核苷酸在一个绝缘子的远端还包含靶序列5'ttaa-3'，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：10(其为seqidno：6的一个实施方案)，紧接着是额外转座子末端序列seqidno：3(其与seqidno：1具有》95％同一性)。基因转移多核苷酸在另一绝缘子的远端还包含额外转座子末端序列seqidno：5(其与seqidno：4具有》95％的同一性)，紧接着是piggybac样转座子反向末端重复序列seqidno：11(其为seqidno：7的一个实施方案)，紧接着是靶序列5'ttaa-3'。[0233]使用来自stemcelltechnologies的easysephumancd8阳性选择试剂盒，根据制造商的说明书，利用来自2个不同的正常供体的外周血单核细胞(pbmc)制备t细胞。通过与辐射的饲养细胞一起孵育来刺激t细胞2-3天，以提供分泌的cd3、cd28、il-2、il-7和il-15。根据制造商的说明书步骤，使用neon电穿孔仪，用0.5μg每种转座子dna和100ng编码序列如seqidno：37所示的转座酶的mrna转染约100,000个t细胞。将转染的t细胞与饲养细胞混合并在37℃下孵育。在转染后的1、7、28、48和54天取样，用荧光标记的抗cd8抗体孵育，并在荧光激活细胞分选仪(facs)上分析cd8和dashergfp。数据示于表13中。[0234]如6.2.1.1节所述，表达gfp的cd8+细胞的富集是基因转移多核苷酸包含赋予t细胞存活或增殖优势的基因的指示物，如5.3.1.1节所述。用编码esrfas/4-1bb和casp7-dn的基因共转染的t细胞显示表达gfp的细胞的百分比随时间增加。转染后1天，4.5％的cd8+细胞也表达gfp。7天后，1.9％的cd8+细胞表达gfp，表明少于2％的cd8+t细胞已经将基因转移多核苷酸整合到它们的细胞核中。转染后28天，31％的cd8+细胞也表达gfp，表明基因转移多核苷酸上的基因使受体细胞能够更好地存活或更快速地增殖。转染后48天，50.4％的cd8+细胞也表达gfp，且转染后54天，超过97％的cd8+t细胞也表达gfp。该数据表明，esrfas/4-1bb和抗凋亡基因casp7-dn的表达提供了显著的存活/增殖优势。[0235]表格说明[0236]表1.人jurkatt细胞系中的爪蟾和家蚕piggybac样转座子[0237]如6.1.1节所述，构建序列如seqidno：223和224所示的包含piggybac样转座子的基因转移多核苷酸。根据制造商的说明书，使用neon电穿孔仪，用1μg质粒dna和100ng编码相应转座酶mrna转染jurkat细胞(每次转染200,000个细胞)。不同时间后(a列中所示)，用抗cd19抗体标记细胞，并通过facs分析细胞群以测定表达cd19的细胞群的百分比。b列显示了基因转移多核苷酸seqidno：223中所含的爪蟾转座子的百分比；c列显示了包含在序列如seqidno：224所示的基因转移多核苷酸内的家蚕转座子的百分比。[0238]表2.jurkat细胞中异源启动子活性的持续时间[0239]如6.1.2.1节所述，将质粒转染到jurkat细胞中，该质粒包含a列中命名的启动子(序列如b列中seqidno所示)和任选的内含子(序列如c列中seqidno所示)，并且还包含序列如seqidno：218至启动子的5'所示的多核苷酸和序列如seqidno：219至启动子的3'所示的多核苷酸。细胞用抗cd19抗体进行荧光标记，并在转染后的不同时间通过流式细胞术进行分析。2天(d列)、8天(e列)、16天(f列)和23天(g列)后显示表面表达cd19的细胞的百分比。h列显示了在第2天和第23天之间表达cd19的细胞的百分比下降。同样的启动子和内含子也与编码gfp的基因可操作地连接，并一式三份瞬时转染到人胚肾(hek)细胞中。转染后48小时在荧光计上计数细胞。来自3个读数的平均荧光强度显示在i列中。[0240]表3.jurkat细胞中异源启动子的活性[0241]如6.1.2.1节所述，将质粒转染到jurkat细胞中，该质粒包含a列中命名的启动子(序列如b列中seqidno所示)和任选的内含子(序列如c列中seqidno所示)，并且还包含序列如seqidno：218至启动子的5'所示的多核苷酸和序列如seqidno：219至启动子的3'所示的多核苷酸。8天后，用抗cd19抗体对细胞进行荧光标记，并通过流式细胞术进行分析。d列显示平均荧光强度。e列显示计算的jurkat细胞表面cd19分子的平均数。[0242]表4.原代t细胞中异源启动子活性[0243]如6.1.2.1节所述，将质粒转染到jurkat细胞中，该质粒包含a列中命名的启动子(序列如b列中seqidno所示)，还包含序列如seqidno：218至启动子的5'所示的多核苷酸和序列如seqidno：219至启动子的3'所示的多核苷酸。11天后，用抗cd19抗体对细胞进行荧光标记，并通过流式细胞术进行分析。c列显示平均荧光强度。[0244]表5.提高原代t细胞的存活率[0245]如6.2.1.2节所述，构建包含piggybac样转座子的基因转移多核苷酸。每个转座子包含一个推定的存活增强基因。通过共转染1μg单一转座子dna和100ng编码序列如seqidno：37(第1-15行)所示的转座酶的mrna制备15个人原代t细胞样品。基因的名称如a列中所示，基因的seqidno如b列中所示。通过共转染0.5μg两种不同转座子的dna(仅在推定的存活增强基因的序列上有所不同)和100ng编码序列如seqidno：37(第16-23行)所示的转座酶的mrna制备8个人原代t细胞样品。第一个基因的名称如a列中所示，第一个基因的seqidno如b列中所示，第二个基因的名称如c列中所示，第二个基因的seqidno如d列中所示。将细胞培养24天，然后通过facs分析cd8作为t细胞标志物的存在，以及gfp作为t细胞基因组中基因转移多核苷酸存在指示物的表达。e列显示分析的淋巴细胞百分比，f列显示分析的活细胞百分比，g列显示表面表达cd8的活细胞百分比，h列显示表达gfp的cd8+细胞百分比。[0246]表6.表达生存素和cd28-d124e-t195p的原代t细胞的离体抗肿瘤活性[0247]如6.2.1.3节所述，在piggybac样转座子上构建编码抗cd19嵌合抗原受体的基因转移多核苷酸。如6.2.1.3节中所述，用转座酶和3个相应转座子其中之一共转染人原代t细胞，该转座子包含编码序列如seqidno：229所示的嵌合抗原受体的基因和gfp报告基因。一个转座子不包含其他基因(a列)，一个转座子还包含编码生存素的基因(b列)，且一个转座子还包含编码cd28-d124e-t195p的基因(c列)。基因转移多核苷酸的序列以第1行中所示的seqidno所示。将细胞培养约5周，此时使用facs测量表达gfp的t细胞的百分比(第2行)。此时，将200,000个t细胞(约200,000个表达gfp的t细胞)与200,000个jy转化的b细胞系混合。混合后3天(第3和4行)或7天(第5和6行)，用荧光标记的抗cd8和抗cd19抗体标记细胞，并使用荧光激活细胞分选仪进行分析。表达cd8的细胞的百分比显示在第4和6行中，表达cd19的细胞的百分比显示在第3和5行中。[0248]表7.表达生存素和cd28-d124e-t195p的原代t细胞的体内抗肿瘤活性[0249]用转座酶和三种相应的基因转移多核苷酸之一共转染人原代t细胞，该基因转移多核苷酸包含如6.2.1.3节和表6所述构建的转座子。转座子的名称显示在a列中，基因转移多核苷酸的序列显示在b列中的seqidno中。转染后培养细胞约5周，然后用facs分选以选择表达gfp的细胞，gfp是转座子在t细胞基因组中存在的指示物。将所选择的细胞在培养物中再生长一周，然后通过腹腔注射向先前7天已经接受腹腔注射1百万个jy细胞的小鼠施用1百万个细胞。施用jy细胞后小鼠存活的时间长度(以天计)示于c列中。第1行和第2行没有接受t细胞，而是对照注射磷酸盐缓冲盐水(pbs)。[0250]表8.提高表达生存素和cd28-d124e-t195p的原代t细胞活性[0251]如6.2.1.3节所述，构建包含piggybac样转座子的基因转移多核苷酸，并将其转染到来自2个不同供体的t细胞中。来自一个供体的细胞离体培养10个月，来自第二个供体的细胞离体培养4个月。如6.2.1.3节所述，通过facs分选表达gfp的cd8+t细胞，然后用nalm6b细胞肿瘤系激发。a列显示离体培养时间，b列显示细胞是否表达异源多核苷酸上编码的生存素基因，c列显示细胞是否表达异源多核苷酸上编码的cd28-d124e-t195p基因。d-h列显示使用发光测定观察到的nalm6的杀伤％。d列：在第0天用nalm6激发的细胞并在第1天测量杀伤作用。e列：在第0天和第2天用nalm6激发的细胞，在第3天测量杀伤作用。f列：在第0天、第2天和第4天用nalm6激发的细胞，在第5天测量杀伤作用。g列：在第0天、第2天、第4天和第6天用nalm6激发的细胞，在第7天测量杀伤作用。h列：在第0天、第2天、第4天、第6天和第8天用nalm6激发的细胞，在第9天测量杀伤作用。[0252]表9.提高原代t细胞的存活率[0253]如6.2.1.5节所述，构建包含piggybac样转座子的基因转移多核苷酸。每个转座子包含一个推定的存活增强基因、esr基因或对照基因。通过共转染1μg单一转座子的dna和100ng编码序列如seqidno：37所示的转座酶的mrna制备来自供体1的人原代t细胞的8个样品(c-f列)和来自供体2的人原代t细胞的8个样品(g-j列)。基因的名称如a列中所示，基因的seqidno如b列中所示。将细胞培养42天，在转染后的不同时间取样，通过facs分析cd8作为t细胞标志物的存在，以及gfp作为t细胞基因组中基因转移多核苷酸存在指示物的表达。c-j列显示了在转染后1天(c和g列)、14天(d和h列)、28天(f和j列)和42天(f和j列)，在其表面(即，cd8+t细胞)表达cd8且也表达gfp的分析细胞的百分比。[0254]表10.提高表达bcl-xl的原代t细胞的活性[0255]如6.2.1.6节所述，构建包含piggybac样转座子的基因转移多核苷酸，并将其转染到来自3个不同供体的t细胞中。如6.2.1.6节所述，240天后，用nalm6b细胞肿瘤系激发细胞。a列显示供体id，b列显示细胞是否含有包含编码bcl-xl的基因的转座子，c列显示培养物是否还含有cd3/cd19结合bite。d-h列显示使用发光测定观察到的nalm6的杀伤％。d列：在第0天用nalm6激发的细胞并在第1天测量杀伤作用。e列：在第0天和第2天用nalm6激发的细胞，在第3天测量杀伤作用。f列：在第0天、第2天和第4天用nalm6激发的细胞，在第5天测量杀伤作用。g列：在第0天、第2天、第4天和第6天用nalm6激发的细胞，在第7天测量杀伤作用。h列：在第0天、第2天、第4天、第6天和第8天用nalm6激发的细胞，在第9天测量杀伤作用。[0256]表11.提高表达生存素和cd28-d124e-t195p的原代t细胞活性[0257]如6.2.1.6b节所述，构建包含piggybac样转座子的基因转移多核苷酸，并将其转染到t细胞中。如6.2.1.6b节所述，通过facs分选表达gfp的cd8+t细胞，然后用nalm6b细胞肿瘤系激发。a列显示细胞是否表达异源多核苷酸上编码的生存素基因，b列显示细胞是否表达异源多核苷酸上编码的cd28-d124e-t195p基因，c列显示细胞是否表达异源多核苷酸上编码的bcl-xl基因。d-i列显示使用发光测定观察到的nalm6的杀伤％。d列：在第0天用nalm6激发的细胞并在第1天测量杀伤作用。e列：在第0天和第2天用nalm6激发的细胞，在第3天测量杀伤作用。f列：在第0天、第2天和第4天用nalm6激发的细胞，在第5天测量杀伤作用。g列：在第0天、第2天、第4天和第6天用nalm6激发的细胞，在第7天测量杀伤作用。h列：在第0天、第2天、第4天、第6天和第8天用nalm6激发的细胞，在第9天测量杀伤作用。i列：在第0天、第2天、第4天、第6天、第8天和第10天用nalm6激发的细胞，在第11天测量杀伤作用。[0258]表12.抗cd28/ox40esr刺激原代t淋巴细胞增殖的研究[0259]如6.2.2.1节所述，构建包含在piggybac样转座子上编码的抗cd28/ox40esr的基因转移多核苷酸。对照转座子包含单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)基因而非esr。通过共转染1μg转座子的dna和100ng编码序列如seqidno：37所示的转座酶的mrna制备来自两个供体的人原代t细胞样品。将细胞培养如a列中所示的天数，然后通过facs分析cd8作为t细胞标志物的存在，以及gfp作为t细胞基因组中基因转移多核苷酸存在的指示物的表达。也表达gfp的表达cd8的细胞的百分比示于b-e列中：用抗cd28/ox40esr转染的供体1细胞(b列)，用hsv-tk转染的供体1细胞(b列)，用抗cd28/ox40esr转染的供体2细胞(c列)，用hsv-tk转染的供体2细胞(d列)。nd：未测试。[0260]表13.esrfas/4-1bb和casp7-dn刺激原代t细胞增殖[0261]如6.2.2.2节所述，在piggybac样转座子上构建编码esr的基因转移多核苷酸，其中fas的胞外结构域与4-1bb的跨膜和胞内结构域融合。如6.2.2.2节所述，在第二piggybac样转座子上构建编码凋亡casp7-dn的显性失活抑制因子的第二基因转移多核苷酸。通过共转染0.5μg每种转座子的dna和100ng编码序列如seqidno：37所示的转座酶的mrna制备来自两个供体的人原代t细胞样品。将细胞培养如a列中所示的天数，然后通过facs分析cd8作为t细胞标志物的存在，以及gfp作为t细胞基因组中基因转移多核苷酸存在的指示物的表达。b列显示也表达gfp的表达cd8细胞的百分比。[0262]表格[0263][0264]表1[0265][0266]表2[0267][0268]表3[0269][0270]表4[0271][0272]表5[0273][0274]表6[0275][0276]表7[0277][0278]表8[0279][0280]表9[0281][0282]表10[0283][0284]表11[0285][0286]表12[0287][0288]表13[0289]本发明包括下列实施例：[0290]1.一种包含免疫细胞存活增强基因的多核苷酸，所述免疫细胞存活增强基因包含与异源调控序列可操作地连接的编码蛋白质的核酸，所述异源调控序列对所述蛋白质在免疫细胞内的表达有效，从而增强所述免疫细胞的存活。[0291]2.根据实施例1所述的多核苷酸，其中所述免疫细胞存活增强基因编码包含激活突变的天然存在的蛋白质。[0292]3.根据实施例1或2所述的多核苷酸，其中所述免疫细胞存活增强基因编码选自包含激活突变的stat3、cd28、rhoa、plcg、stat5b或ccnd1的蛋白质。[0293]4.根据实施例3所述的多核苷酸，其中所述免疫细胞存活增强基因编码stat3，其中所述stat3包含以下激活突变中的一个或多个：f174s、h410r、s614r、e616k、g618r、y640f、n647i、e652k、k658y、k658r、k658n、k658m、k658r、k658h、k658n、d661y或d661v。[0294]5.根据实施例3所述的多核苷酸，其中所述免疫细胞存活增强基因编码cd28，其中所述cd28包含以下激活突变中的一个或多个：d124e、d124v、t195i或t195p。[0295]6.根据实施例3所述的多核苷酸，其中所述免疫细胞存活增强基因编码rhoa，其中所述rhoa包含以下激活突变中的一个或多个：g17v或k18n。[0296]7.根据实施例3所述的多核苷酸，其中所述免疫细胞存活增强基因编码plcg，其中所述plcg包含以下激活突变中的一个或多个：s345f、s520f或r707q。[0297]8.根据实施例3所述的多核苷酸，其中所述免疫细胞存活增强基因编码stat5b，其中所述stat5b包含以下激活突变中的一个或多个：n642h、t648s、s652y、y665f或p267a。[0298]9.根据实施例3所述的多核苷酸，其中所述免疫细胞存活增强基因编码ccnd1，其中所述ccnd1包含以下激活突变中的一个或多个：e36g、e36q、e36k、a39s、s41l、s41p、s41t、v42e、v42a、v42l、v42m、y44s、y44d、y44c、y44h、k46t、k46r、k46n、k46e、c47g、c47r、c47s、c47w、p199r、p199s、p199l、s201f、t285i、t285a、p286l、p286h、p286s、p286t或p286a。[0299]10.根据实施例1所述的多核苷酸，其中所述免疫细胞存活增强基因编码天然存在的人蛋白质。[0300]11.根据实施例10所述的多核苷酸，其中所述免疫细胞存活增强基因编码选自生存素(survivin)、bcl2、bcl6或bcl-xl的蛋白质。[0301]12.根据实施例1所述的多核苷酸，其中所述免疫细胞存活增强基因编码凋亡抑制因子。[0302]13.根据任一前述实施例所述的多核苷酸，其中所述异源启动子选自ef1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、eef2启动子、泛素启动子、sv40启动子或hsvtk启动子。[0303]14.根据实施例1-12所述的多核苷酸物，其中所述异源启动子选自seqidno：94-154。[0304]15.根据任一前述实施例所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含选自seqidno：6和7、或seqidno：14和15、或seqidno：18和19、或seqidno：20和21、或seqidno：26和27、或seqidno：399和400的序列对。[0305]16.根据任一前述实施例所述的多核苷酸，其中相对于基因组不包含所述多核苷酸的免疫细胞的半衰期，所述基因组包含所述多核苷酸的免疫细胞的半衰期增加至少25％。[0306]17.根据任一前述实施例所述的多核苷酸，其中相对于基因组不包含所述多核苷酸的免疫细胞的最大寿命，所述基因组包含所述多核苷酸的免疫细胞的最大寿命增加至少25％。[0307]18.根据任一前述实施例所述的多核苷酸，其中相对于基因组包含所述多核苷酸的免疫细胞的倍增时间，所述基因组不包含所述多核苷酸的免疫细胞的倍增时间高出至少25％。[0308]19.根据任一前述实施例所述的多核苷酸，其中相对于基因组不包含所述多核苷酸的免疫细胞的增殖速率，所述基因组包含所述多核苷酸的免疫细胞的增殖速率增加至少25％。[0309]20.根据任一前述实施例所述的多核苷酸，其中相对于基因组不包含所述多核苷酸的免疫细胞的存活率，所述基因组包含所述多核苷酸的t细胞在重复抗原激发后的存活率增加至少25％。[0310]21.一种转座子，其包含前述实施例中任一项所述的多核苷酸。[0311]22.一种慢病毒载体，其包含实施例1-20中任一项所述的多核苷酸。[0312]23.一种产生修饰的免疫细胞的方法，所述方法包括将与异源启动子可操作地连接的编码凋亡抑制因子的多核苷酸导入免疫细胞。[0313]24.根据实施例23所述的方法，其中所述多核苷酸还包含转座子末端，并且其中所述方法还包括将相应的转座酶导入所述免疫细胞，使得编码所述凋亡抑制因子的多核苷酸被转座到所述免疫细胞的基因组中。[0314]25.根据实施例23或24所述的方法，其中所述转座酶作为编码转座酶的核酸被导入。[0315]26.根据实施例25所述的方法，其中所述核酸为mrna。[0316]27.根据实施例24或25所述的方法，其中编码所述转座酶的所述核酸与在所述免疫细胞中有活性的启动子可操作地连接。[0317]28.根据实施例24所述的方法，其中将所述转座子和转座酶同时导入所述免疫细胞中。[0318]29.根据实施例24所述的方法，其中将所述转座子和转座酶在不同时间导入所述免疫细胞中。[0319]30.根据实施例23-29中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞为t细胞，所述方法还包括将编码能够结合抗原的受体的基因导入所述免疫细胞，其中所述受体与在其表面展示所述抗原的靶细胞结合导致所述t细胞杀伤所述靶细胞。[0320]31.根据实施例23-29中任一项所述的方法，其中所述凋亡抑制因子选自生存素、bcl2、bcl6、bcl-xl或casp3、casp7、casp8、casp9或casp10的显性失活突变体。[0321]32.一种产生修饰的免疫细胞的方法，所述方法包括将编码选自stat3、cd28、rhoa、plcg、stat5b或ccnd1的蛋白质的多核苷酸导入免疫细胞，其中所述蛋白质包含与异源启动子可操作地连接的激活突变。[0322]33.一种产生修饰的免疫细胞的方法，所述方法包括将编码多肽的多核苷酸导入免疫细胞，所述多肽包含[0323]a.衍生自通常向免疫细胞传递抑制信号的受体的胞外结构域的序列[0324]b.衍生自向免疫细胞传递刺激信号的受体的胞内结构域的序列[0325]c.跨膜结构域[0326]并且其中所述多肽不包含cd3ζ胞内结构域。[0327]34.根据实施例33所述的方法，其中所述胞外结构域包含选自seqidno：322-340的序列。[0328]35.根据实施例33所述的方法，其中所述胞内结构域包含选自seqidno：341-364的序列。[0329]36.根据实施例33或34所述的方法，其中所述多肽包含选自seqidno：274-318的序列。[0330]37.一种免疫细胞，其基因组包含实施例1-22中任一项所述的多核苷酸。[0331]38.根据实施例37所述的免疫细胞，其中相对于基因组不包含实施例1所述的多核苷酸的免疫细胞的半衰期，所述免疫细胞的半衰期增加至少25％。[0332]39.根据实施例37或38所述的免疫细胞，其中相对于基因组不包含实施例1所述的多核苷酸的免疫细胞的最大寿命，所述免疫细胞的最大寿命增加至少25％。[0333]40.根据实施例37-39中任一项所述的免疫细胞，其中相对于基因组包含实施例1所述的多核苷酸的免疫细胞的半衰期，所述基因组不包含根据实施例1所述的多核苷酸的免疫细胞的倍增时间增加至少25％。[0334]41.根据实施例37-40中任一项所述的免疫细胞，其中相对于基因组不包含实施例1所述的多核苷酸的免疫细胞的增殖速率，所述免疫细胞的增殖速率增加至少25％。[0335]42.根据实施例37-41中任一项所述的免疫细胞，其中相对于基因组不包含所述多核苷酸的免疫细胞的存活率，所述基因组包含所述多核苷酸的t细胞在重复抗原激发后的存活率增加至少25％。[0336]43.根据实施例37-42中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞为t细胞。[0337]44.根据实施例37-42中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞为b细胞。[0338]45.根据实施例37-42中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞为人细胞。[0339]46.根据实施例37-42中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞为灵长类细胞、啮齿动物细胞、猫细胞、狗细胞或马细胞。[0340]47.根据实施例1所述的多核苷酸，其中所述免疫细胞存活增强基因编码增强型信号传导受体(esr)，其中所述esr包含：[0341]a.衍生自通常向免疫细胞传递抑制信号的受体的胞外结构域的序列[0342]b.衍生自向免疫细胞传递刺激信号的受体的胞内结构域的序列[0343]c.跨膜结构域[0344]并且其中所述esr不包含cd3ζ胞内结构域[0345]48.根据实施例47所述的多核苷酸，其中所述胞外结构域(a)衍生自选自以下的人蛋白质：tnfrsf3(ltrβ)、tnfrsf6(fas)、tnfrsf8(cd30)、tnfrsf10a(dr4)、tnfrsf10b(dr5)、tnfrsf19(troy)、tnfrsf21(dr6)和ctla4。[0346]49.根据实施例47所述的多核苷酸，其中所述esr包含与选自seqidno：322-340的序列具有至少90％同一性的序列。[0347]50.根据实施例47-49中任一项所述的多核苷酸，其中所述胞内结构域(b)衍生自选自以下的人蛋白质：tnfrsf4(ox40)、tnfrsf5(cd40)、tnfrsf7(cd27)、tnfrsf9(4-1bb)、tnfrsf11a(rank)、tnfrsf13b(taci)、tnfrsf13c(baff-r)、tnfrsf14(hvem)、tnfrsf17(cd269)、tnfrsf18(gitr)、cd28、cd28h(tmigd2)、诱导型t细胞共刺激因子(icos/cd278)、dnax辅助分子1(dnam-1/cd226)、信号转导淋巴细胞激活分子(slam/cd150)、t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域(tim-1/havcr-1)、干扰素受体α链(ifnar1)、干扰素受体β链(ifnar2)、白细胞介素2受体β亚基(il2rb)、白细胞介素2受体γ亚基(il2rg)、肿瘤坏死因子超家族14(tnfsf14/light)、自然杀伤细胞2族成员d(nkg2d/cd314)和cd40配体(cd40l)。[0348]51.根据实施例47-50中任一项所述的多核苷酸，其中所述esr包含与选自seqidno：341-364的序列具有至少90％同一性的序列。[0349]52.根据实施例47-51中任一项所述的多核苷酸，其中所述esr包含与选自seqidno：365-396的序列具有至少90％同一性的序列。[0350]53.根据实施例45-52中任一项所述的多核苷酸，其中所述esr包含与选自seqidno：274-318的序列具有至少90％同一性的序列。[0351]54.根据实施例47-53中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含与异源启动子可操作地连接的编码凋亡抑制因子的片段。[0352]55.一种免疫细胞，其基因组包含实施例47-54中任一项所述的多核苷酸。[0353]56.根据实施例55所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞基因组还包含与异源启动子可操作地连接的编码凋亡抑制因子的片段。[0354]57.一种产生修饰的免疫细胞的方法，所述方法包括[0355]a.向所述免疫细胞中导入实施例47所述的多核苷酸。[0356]b.将与异源启动子可操作地连接的编码凋亡抑制因子的多核苷酸导入所述免疫细胞中。[0357]58.根据实施例57所述的方法，其中将这两种多核苷酸同时导入所述免疫细胞中。[0358]59.一种鉴定提高免疫细胞存活率的蛋白质的方法，包括[0359]对来自癌性免疫细胞的编码蛋白质的核酸进行测序以鉴定编码具有突变的蛋白质的核酸；[0360]用编码具有突变的所述蛋白质的核酸转化免疫细胞；以及确定所述免疫细胞是否具有提高的存活率。[0361]7.参考文献[0362]本文引用的所有参考文献通过引用整体并入本文，并且出于所有目的，并入程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请被具体地和单独地指示为通过引用整体并入本文。如果不同的内容与在不同时间的引用相关联，则意味着与在本发明的优先权日的引用相关联的内容。[0363]在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行许多修改和改变，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。本文所述的具体实施方案仅通过举例的方式提供，并且本发明仅受所附权利要求的术语以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围的限制。当前第1页12当前第1页12
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