易基因｜m5C甲基化研究揭示mRNA m5C对维持果蝇生殖

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

易基因｜m5C甲基化研究揭示mRNA m5C对维持果蝇生殖干细胞发育的分子机制

2022-04-19 11:34 来源: 深圳易基因科技

原标题：易基因｜m5C甲基化研究揭示mRNA m5C对维持果蝇生殖干细胞发育的分子机制

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2020年02月18日，Stower研究所解亭教授团队与南方科技大学李思思团队合作研究发现果蝇的YPS蛋白通过优先结合带有m5C修饰的RNA，从而促进果蝇卵巢生殖干细胞的发育。该成果以“Drosophila YBX1 homolog YPS promotes ovarian germ line stem cell development by preferentially recognizing 5-methylcytosine RNAs”为题在线发表在《美国国家科学院院刊》（PNAS）（IF 11.205）期刊上。

易基因｜m5C甲基化研究揭示mRNA m5C对维持果蝇生殖

摘要：

m5C是一种存在于tRNA和rRNA中的RNA修饰，最近在mRNA中发现。虽然有人提出m5C RNA修饰可以调节多种生物学功能，但m5C RNA修饰是否会影响成体干细胞发育尚不清楚。在本研究中，研究人员发现YPS蛋白（Ypsilon schachtel）是人Y-框结合蛋白1(Y box binding protein 1 ,YBX1)的人源同类蛋白，可以通过优先结合带有m5C修饰的RNA，从而促进果蝇卵巢生殖干细胞（GSC）的维持、增殖和分化。遗传学证明YPS在果蝇卵巢中具有GSC维持、增殖和分化功能，人YBX1可以在功能上替代YPS支持GSC正常发育。YPS和YBX1的保守冷休克结构域（cold-shock domains,CSD）在体外优先与m5C RNA结合。此外，YPS还优先与生殖细胞中带有m5C修饰的RNA（包括mRNAs）结合。YBX1 CSD-RNA复合物的晶体结构表明，疏水相互作用和氢键对m5C结合至关重要。RNA结合缺失突变YPS和YBX1蛋白表达会阻碍GSC发育。综上所述，研究结果表明m5C RNA修饰在成人干细胞发育中起着重要作用。

背景：

近几年，由于表观转录组学的兴起，m5C作为mRNA中除 m6A之外另一种广泛存在的修饰，引起了研究人员们的关注。然而，其调控细胞发育和分化机制的机理目前尚不清楚。

研究材料：

室温条件下，在标准玉米粉/糖蜜/琼脂培养基上饲养和杂交果蝇。为最大限度提高shRNA和转基因的表达水平，在分析卵巢表型之前，将新羽化的果蝇在29°C条件下培养2周。取卵巢组织分离RNA用于研究。

结果：

（1）YPS促进果蝇卵巢的GSC维持，增殖和分化

研究人员们首先发现YPS蛋白缺失的2周龄果蝇卵巢干细胞显现出发育延迟，增值变慢的现象，提示该蛋白对于果蝇生殖干细胞的维持，增殖以及分化具有重要作用。由于YPS的人源同类蛋白YBX1与mRNA m5C甲基化酶NSUN2共定位于外泌体中，且YPS本身含有能够结合核酸的保守的cold-shock结构域，研究团队推测YPS可能通过结合含有甲基化的mRNA来行使功能。

易基因｜m5C甲基化研究揭示mRNA m5C对维持果蝇生殖

图1：YPS本质上是为了促进GSC维持、增殖和分化

（2）人YBX1可以在功能上取代YPS，促进果蝇卵巢GSC发育

为了验证推测，研究团队首先在YPS缺失的果蝇生殖干细胞中回补表达人源的同类蛋白YBX1，发现YBX1可以替代YPS促进果蝇生殖干细胞正常发育，证明两个同源蛋白在功能上具有保守性。同时通过Flag-pulldown，免疫共沉淀以及高通量测序的方法发现YPS确实能在体内结合更多含有m5C修饰的mRNA。

易基因｜m5C甲基化研究揭示mRNA m5C对维持果蝇生殖

图2：YPS优先与生殖细胞中带有m5C修饰的RNA结合

（3）YBX1-CSD主要通过疏水相互作用对带有m5C修饰的RNA优先结合

研究人员利用ITC以及蛋白晶体结构解析等技术，对比YBX1蛋白结合甲基化修饰的RNA以及非甲基化修饰的RNA的高分辨率复合物结构，发现在YPS和YBX1中高度保守的4个氨基酸（Trp65、Phe74、Phe85、His87）对于识别和结合甲基化修饰的RNA至关重要。其中，RNA甲基化增强了RNA与蛋白之间的疏水相互作用，确保YPS和YBX1在体内与甲基化的RNA具有更高亲和力。

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图3：果蝇YPS和人YBX1的CSD优先与带有m5C修饰的RNA结合

（4）RNA结合缺失突变YBX1和YPS蛋白表达严重打乱GSC发育