CRISPR/Cas9系统的一种新应用的制作方法

作者：张馨予

crispr/cas9系统的一种新应用
技术领域
1.本发明涉及生物工程领域，具体而言，本本发明涉及一种新的基于crispr/cas9系统的基因组编辑系统及其应用。

背景技术：

2.规律成簇间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crispr)系统是细菌和古细菌抵御外源dna或rna入侵的一种适应性免疫系统。以该系统为基础，经过人为改造得到的基因组编辑工具crispr/cas系统目前已广泛应用于植物、动物和微生物的基因组编辑。crispr/cas9系统由两个部分：cas9核酸酶和向导rna组成。cas9在向导rna的靶向作用下，靶定到基因组的特定位置对dna双链进行切割。切割后的双链dna可通过非同源末端连接(non-homologous end joining，nhej)途径进行修复，产生插入缺失(indel)，是非精确的修复方式。也可通过提供同源片段，利用同源重组(homologous recombination，hr)的修复方式进行修复，是一种精确的修复方式。目前crispr/cas9基因组编辑系统也已广泛应用于大肠杆菌、假单胞菌等菌株中。
3.大多数细菌不具有dna双链断裂末端修复的非同源末端连接(nhej)途径，因此为了防止细菌的死亡，通常将crispr系统与同源重组(hr)结合应用于基因组编辑。目前在细菌中常用的crispr技术是通过两个质粒系统分别表达cas9和sgrna实现对细菌基因组的编辑。此外，在crispr/cas9系统中引入λ-red同源重组系统可增强细菌基因编辑的同源重组修复效率，来源于噬菌体的λ-red同源重组系统由三种蛋白组成：gam蛋白可阻止内源核酸酶对外源dna的降解，exo蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链dna的末端，从5’端向3’端降解dna，产生3’突出端；之后beta蛋白结合在单链dna上，介导互补单链dna退火。
4.目前在水稻黄单胞菌(xanthomonas oryzae)中常用的突变体构建方式主要有三种，转座子突变、单交换插入突变和双交换的同源重组。转座子突变和单交换插入突变由于都引入了标记基因，有可能造成极性效应。并且由于标记基因的存在，不便于之后继续进行遗传操作。双交换的同源重组可以实现无标记基因残留的突变，避免了极性化的影响，但这种方式需要两次同源重组，费时费力，且第二次同源重组有可能得到突变体，但也有可能恢复到野生型。因此，本领域中仍然需要更高效，快速，且可进行多基因敲除的遗传操作系统，特别是能够用于黄单胞菌属，特别是水稻黄单胞菌的这种遗传操作系统。

技术实现要素：

5.发明人通过如下项目所公开的技术方案解决了本领域中存在的上述问题：
6.1.一种基于crispr/cas9系统的基因组编辑系统，其包含载体1和载体2，其中载体1包含可操作地连接的cas9核酸酶的编码核酸序列和λ-red同源重组系统的编码核酸序列，载体2包含可操作地连接的用于靶定到基因组特定位置的向导rna的编码核酸序列、用于目标突变体构建的同源重组片段的核酸序列和可被诱导表达以靶定到载体2自身的向导rna的编码核酸序列。
7.2.项目2所述的基因组编辑系统，其中所述载体1和载体2为质粒。
8.3.项目1或2所述的基因组编辑系统，其中所述cas9和λ-red同源重组系统的编码核酸序列如seq id no:3所示。
9.4.项目1或2所述的基因组编辑系统，其中所述用于目标突变体构建的同源重组片段的核酸序列的长度为200～2000bp，优选300～1000bp。
10.5.项目1或2所述的基因组编辑系统，其中可被诱导表达以靶定到载体2自身的向导rna的编码核酸序列如seq id no:6所示。
11.6.项目2所述的基因组编辑系统，其中所述载体2的核苷酸序列如seq id no:7所示。
12.7.对细胞进行基因编辑的方法，其包括将项目1-6任一项所述的基因组编辑系统引入所述细胞，其中所述细胞为细菌，优选单黄胞菌属(xanthomonas)，更优选水稻单黄胞菌(xanthomonas oryzae)的细胞。
13.8.项目1-6任一项所述的基因组编辑系统在制备基因编辑细胞中的用途，其中所述所述基因编辑为基因敲除或替换等，优选多个基因的编辑。
附图说明
14.图1：pxo99a中两个质粒系统的图谱。其中图1a为pxo99 a
中建立的crispr/cas9系统的载体图谱，n20指的是靶定到pseva-sgrna质粒复制起始点pro1600区域的20nt的向导序列，mcs为多克隆位点。图1b显示向导序列构建到pseva-sgrna质粒的方式。
15.图2：通过crispr/cas9系统敲除pxo99a基因xanb2。其中图2a显示pseva系列质粒转入含有phm1-crispr的pxo99a后的表型，pseva-nsgrna作为阴性对照，表达不能靶定到基因组上的sgrna，转化用的质粒dna量一致，标尺＝1cm；图2b显示用于验证xanb2基因敲除的引物设计示意图，闪电形箭头指sgrna在xanb2基因上的识别位置；左右方向的箭头示意设计的xanb2鉴定引物位置和方向；图2c为验证xanb2敲除的pcr凝胶电泳结果。图2d显示dna测序结果，确认xanb2基因的1004nt被成功删除。
16.图3：crispr/cas9系统的4种组分对pxo99a的基因编辑的影响。图3a为不同组分转入pxo99a中的策略。带有不同组分的phm1质粒先转入pxo99a中，之后不同形式的pseva质粒通过电击转入含有phm1质粒的pxo99a中；图3b显示不同组合的编辑系统的转化效率和突变效率；转化用的质粒dna量一致，转化后的细菌涂在含相同浓度抗生素的平板上；cfu，菌落形成单位；nd，未检测到；ha，同源臂；数值为平均值
±
标准差，n＝4。
17.图4：不同同源臂长度对基因编辑的影响。比较上下游同源臂各100至1000bp对基因编辑的影响。转化用的质粒dna量一致，转化后的细菌涂在含相同浓度抗生素的平板上；cfu，菌落形成单位；nd，未检测到。数值为平均值
±
标准差，n＝4。
18.图5：通过crispr/cas9基因组编辑系统实现基因的替换。图5a显示基因替换所需的靶位点及同源片段示意图，闪电形箭头指sgrna在tatc基因上的识别位置；左右方向的箭头示意设计的突变菌株鉴定引物位置和方向；图5b显示pseva系列质粒转入含有phm1-crispr的pxo99a后在含有卡那抗性及庆大霉素抗性的psa平板上的表型，标尺＝1cm；图5c显示编辑后的菌落pcr凝胶电泳结果。
具体实施方式
19.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
20.本文所用的百分比浓度为质量体积百分比浓度。
21.本文中所用的术语具有本领域所通常理解的含义。
22.特别地，本文所用的术语“可操作地连接”是指例如载体(例如质粒)中所连接的序列以实现其功能的方式连接。
23.方法
24.pxo99a电击感受态的制备及电击转化方法
25.(1)在m210固体平板上划线活化水稻黄单胞菌白叶枯致病变种菌株pxo99a(本实验室保存菌株，ncbi reference sequence:nc_010717.2)，28℃培养2-3天后接种至5ml液体m210培养基中，28℃、220rpm培养过夜。
26.(2)将过夜培养的菌液按照1.5％-2％(体积比)的比例转接至250ml的m210液体培养基(5g蔗糖，8g酶水解酪素，4g酵母提取物，3g k2hpo
4 0.3g mgso4.7h2o，定容至1l，ph值为7.0)中，28℃、220rpm培养至od
600
值在0.5-0.6之间。
27.(3)将菌液至于冰上冷却20min，然后将菌液转移至离心筒中于4℃、4000转/分钟离心回收菌体，并用预冷的10％的甘油洗涤菌体3次。最后用1ml预冷的10％的甘油重悬菌体，每100μl分装于一个1.5ml离心管中，液氮速冻后放入-80℃冻存备用。
28.(4)将目的质粒加入解冻的pxo99a感受态，然后转移至预冷的电击杯中，用bio-rad micropulser电击仪在agr参数项下进行电击，电击后加入900μl ps液体培养基(10g蛋白胨，10g蔗糖，1.27g l-谷氨酸钠
·
h2o，定容至1l，ph值为7.0)于28℃摇床复苏，4小时后将菌液涂至含有相应抗生素的psa平板上，放于28℃温箱中培养2-3天。
29.crispr/cas9系统在pxo99a中应用的基因编辑方法
30.(1)将质粒phm1-crispr转入pxo99a或待编辑的突变菌株中。
31.(2)制备含有质粒phm1-crispr的相应菌株的电击感受态细胞。转接培养至od
600
值在0.2-0.3时，加入10mm的l-阿拉伯糖诱导λ-red重组系统表达。继续培养至od
600
值在0.5-0.6时，制备电击感受态细胞。
32.(3)将2μg质粒pseva-δx电转至感受态细胞中。使用bio-rad micropulser电击仪在agr参数项下进行电击，电击后加入900μl液体ps培养基于28℃复苏，4小时后将菌液涂至含有壮观霉素(100mg/l)及庆大霉素(50mg/l)抗性的psa平板上，放于28℃温箱培养2-3天。
33.(4)通过突变体鉴定引物对细菌基因组进行pcr扩增确定是否发生相应的突变，并通过测序验证。
34.(5)基因组再编辑及质粒消除。
35.1.将需要消除质粒pseva-δx的菌落摇菌，加入10mm的l-鼠李糖，24小时后在仅含有壮观霉素抗性的psa平板上划线，2-3天后挑取单菌落分别在含有壮观霉素抗性的psa平板和含有壮观霉素及庆大霉素抗性的psa平板上点板。若菌落在壮观霉素和庆大霉素双抗性平板上不能生长，在壮观霉素抗性平板上可以生长，则证明质粒pseva-δx消除成功。之后可重复步骤(2)对突变菌株进行再编辑。
36.2.需要将质粒phm1-crispr和pseva-δx都消除时，在l-鼠李糖诱导24小时后将菌
液至于冰上冷却20min，然后将菌液转移至离心筒中于4℃离心回收菌体，并用预冷的10％的甘油洗涤菌体3次，之后用10％甘油重悬感受态细胞。将感受态细胞转移至预冷的电击杯中，用bio-rad micropulser电击仪在agr参数项下进行电击，电击后加入900μl ps液体培养基于28℃摇床复苏，4小时后将菌液在无抗性的psa平板上划线。2-3天后挑取单菌落分别在壮观霉素抗性、庆大霉素抗性、无抗性的psa平板上点板。若菌落在壮观霉素抗性和庆大霉素抗性平板上不能生长，仅在无抗性平板上可以生长，则证明两个质粒均消除成功。
37.实施例1.phm1-crispr及pseva-sgrna质粒的构建图谱。
38.在水稻黄单胞菌中常用的稳定表达蛋白的质粒是phm1(genbank:ef059993.1)，因此将质粒phm1用于表达cas9和λ-red同源重组系统。通过同源重组的方式构建质粒phm1-crispr，使用yeasen的一步法快速克隆试剂盒(hieff clone
tm plus one step cloning kit)。基本操作步骤如下：(1)插入片段引物的设计。在插入片段正、反向pcr引物的5’端引入约20bp与线性化载体两末端对应的完全一致的同源序列。(2)插入片段的pcr扩增以及载体的线性化。以pcas-rk2t载体(molecularcloud公司,产品编号mc_0000261)为模板，使用neb公司的q5高保真聚合酶扩增，通过引物5
’-
atttcacacaggaaacagctatggataagaaatactcaataggctt ag-3’(正向引物，seq id no:1)和5
’-
cactgaacgtcagaagccgactactggtattggcacaaacctg-3’(反向引物，seq id no:2)进行pcr扩增。之后对产物进行纯化。(3)插入片段与线性化载体的重组反应。通过psti和sali对质粒phm1进行酶切纯化，获得线性化的phm1载体。hieff clonetm重组反应体系最适载体使用量为0.03pmol；最适载体与插入片段摩尔比为1:2-1:3。计算得到线性化载体xμl和插入片段用量yμl。反应体系为：10μl 2
×
hieff clone enzyme premix；xμl线性化载体；yμl插入片段；加ddh2o至20μl。体系配制完成后，置于50℃反应20min。(4)重组产物转化和鉴定。取10μl重组产物热激转化感受态细胞dh5α，复苏后涂于含壮观霉素抗性的lb平板，放于37℃温箱培养过夜。之后对其进行菌落pcr和测序鉴定。如图1a所示，cas9基因由质粒phm1携带的lac启动子组成型表达，λ-red同源重组系统通过l-阿拉伯糖诱导表达，cas9基因及λ-red同源重组系统的核苷酸序列见seq id no:3。
39.在质粒pseva-gric6t(molecular cloud公司,产品编号mc_0000262)的基础上进行改造，构建了质粒pseva-sgrna用于表达sgrna。改造主要分3方面，一是在组成型启动子j23119与grna scaffold间加入含两个bsai识别位点的序列(5
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agagacctgaattctggtctca-3’，seq id no:4)，便于sgrna的构建。二是将质粒pseva-gric6t上带有的同源片段替换成多克隆位点序列(5
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ggatcccgtcgactctgcaggcatgcaagctt-3’，seq id no:5)，最终质粒共包含7个单酶切位点，分别为saci、kpni、bamhi、sali、psti、hindiii、noti，便于同源片段的连接。三是在多克隆位点后连接鼠李糖诱导的靶定到自身质粒复制起始点pro1600区域的sgrna，20bp的向导序列为5
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tggcctgtagacgtcctaaa-3’(seq id no:6)。最终得到的质粒pseva-sgrna完整核酸序列见seq id no:7。
40.通过网站https://design.synthego.com/#/设计无脱靶的sgrna。在向导序列正向引物5’端加上“tagc”，反向引物5’端加上“aaac”，具体如图1b所示。合成引物退火后与bsai酶切消化过的pseva-sgrna通过t4连接酶进行连接，即得可表达sgrna的质粒pseva-sgrna。
41.通过q5高保真聚合酶(neb公司，货号：m0491l)从pxo99a基因组上选择合适的区域作为上下游同源臂进行扩增，扩增体系为50μl：5xq5反应缓冲液10μl；10mm dntps 1μl；10μ
m正向引物2.5μl；10μm反向引物2.5μl；q5 high-fidelity dna polymerase 0.5μl；genomic dna100ng；加ddw至50μl。反应程序为：98℃30s；98℃10s，60℃20s，72℃30s，35个循环，72℃2min。之后通过融合pcr将扩增的上下游两个同源臂融合成一个片段，引物为上游同源臂的正向引物和下游同源臂的反向引物。扩增体系为50μl：5xq5反应缓冲液10μl；10mm dntps1μl；10μm正向引物2.5μl；10μm反向引物2.5μl；q5 high-fidelity dna polymerase 0.5μl；上游同源片段100ng；下游同源片段100ng；加ddw至50μl。扩增后纯化融合的同源片段，以酶切连接的方式将同源片段构建到质粒pseva-sgrna上，得到质粒pseva-δx。
42.实施例2.在pxo99a中实现crispr/cas9基因编辑
43.为了验证设计的crispr/cas9系统在水稻黄单胞菌白叶枯致病变种(xanthomonas oryzae pv.oryzae，xoo)pxo99a中可以工作，选择了编辑xanb2基因用来检测crispr/cas9系统在pxo99a中的编辑效率。xanb2是负责菌黄素生物合成的pig基因簇中的一员，相关的核苷酸序列如seq id no：8所示。xanb2通过水解分支酸产生3-hba(3-羟基苯甲酸)和4-hba，其中3-hba主要介导菌黄素(xanthomonadins)的合成。菌黄素附着于细菌细胞膜的外膜上，从而使得菌落呈黄色。该基因突变后，菌株不能正常产生菌黄素，突变菌株菌落呈白色，因此可直接通过菌落颜色判断基因编辑是否成功。
44.通过网站https://design.synthego.com/#/帮助设计无脱靶位点的sgrna-xanb2，相关的核苷酸序列如seq id no：9所示，构建所用正向引物为5
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tagccggactgggcgcattcgaca-3’(见seq id no:10)，反向引物为5
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aaactgtcgaatgcgcccagtccg-3’(见seq id no:11)。引物退火后连接到bsai酶切后的质粒pseva-sgrna上，得到质粒pseva-sgxanb2。在xanb2基因两端分别选取约500bp的片段进行pcr扩增(上游同源臂正向引物：5
’-
cgggatcctctatcgtaactgcacgtaatgccccctc-3’，seq id no:12；上游同源臂反向引物：5
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cgctcaatgaaggatgctgtacgtgcggatgctg-3’，seq id no:13；下游同源臂正向引物：5
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acagcatccttcattgagcgtctcgttgttgcgtg-3’，seq id no:14；下游同源臂反向引物：5
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cgggatccacgaatgcacgcgcatggcag-3’，seq id no:15)，扩增体系及反应程序详见实施例1。之后将上下游同源片段通过融合pcr的方法得到上下游同源臂融合的约1000bp片段(相关的核苷酸序列如seq id no：16所示)。扩增后的片段纯化后通过bamhi和hindiii酶切连接后构建到质粒pseva-sgrna上，最终得到的质粒pseva-δxanb2用于以同源重组的方式实现对xanb2基因的敲除。此外，设计不靶定到pxo99a基因组的任何位点的sgrna，其向导序列为cattcagaactaacttgtcg(seq id no:43)，合成引物5
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tagccattcagaactaacttgtcg-3’(seq id no：17)和5
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aaaccgacaagttagttctgaatg-3’(seq id no：18)，引物退火后连接到bsai酶切后的质粒pseva-sgrna上，得到质粒pseva-nsgrna。
45.将质粒pseva-δxanb2电转入含有phm1-crispr质粒的pxo99a电击感受态细胞中，复苏后涂至含有壮观霉素(100mg/l)和庆大霉素(50mg/l)双抗性的psa平板上。如图2a所示培养3天后发现，转有pseva-δxanb2的平板上，菌落均呈现白色，而转化作为对照的pseva-nsgrna后的平板上仍是正常的黄色菌落，证明pseva-δxanb2确实实现了对基因xanb2的敲除。通过鉴定引物xanb2-confirm-f(5
’-
ggtgtcaaagattcagtccgttgag-3’，seq id no：19)和xanb2-confirm-r(5
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caagtggttcatctaccgcttcac-3’，seq id no：20)进行pcr鉴定，证明xanb2基因被敲除。测序结果也证明了这一点。这一结果证明设计的crispr/cas9基因编
辑系统在pxo99a中得到了成功的应用。
46.实施例3.pxo99a中的crispr/cas9系统需要所有组分共同参与
47.在构建的crispr/cas9系统需要4个组分，分别是cas9、sgrna、同源片段以及λ-red重组系统。为了确定这4个组分对在pxo99a中进行基因编辑是否是必需的，设计了5组不同的组合，依旧选择编辑xanb2基因。
48.如图3，当pxo99a中只表达cas9和可靶定到xanb2基因的sgrna时，由于cas9可以在sgrna的靶向作用下切割pxo99a基因组，因此最终不会得到任何菌落。若将sgrna换成不靶向pxo99a基因组的nsgrna时，转化后可正常得到菌落，但菌落颜色均为正常的黄色。若在cas9和sgrna表达的同时，质粒上带有xanb2的同源臂，此时，cas9和sgrna可以正常行使切割功能，但同源片段的存在并不能修复断裂的细菌基因组，可能是由于pxo99a菌株自身的同源重组系统效率低导致的。若在pxo99a中转入λ-red重组系统，之后转入xanb2同源片段，可以正常得到菌落，且其中有约18％为xanb2敲除后的白色菌落，证明向pxo99a中转入λ-red重组系统提高同源重组效率即可作为一种新的基因编辑方式，但这种方式效率太低，对菌落形态没有变化的基因突变，需要大量的鉴定工作才能鉴定到突变菌株。只有在cas9、sgrna、λ-red重组系统以及同源片段同时存在的条件下，才能得到正常的菌落，且菌落全为xanb2敲除后的白色菌落，并经pcr验证这一结果，证明编辑效率确实达到100％。这些结果说明crispr/cas9系统中的4个组分对于其在pxo99a中实现正确高效的基因编辑都是必需的。
49.实施例4.同源臂长度对基因编辑的影响
50.同源片段对crispr/cas9系统在pxo99a中的基因编辑是必需的，测试了不同同源臂长度是否影响基因编辑效率。使用靶向xanb2的同一个sgrna，设计从100-1000bp的不同同源臂长度(构建用上游同源臂正向引物及下游同源臂反向引物见seq id no:21-seq id no:30)，构建到载体pseva-sgrna上电转至诱导表达重组系统的pxo99a/phm1-crispr感受态细胞。当选择上下游同源臂各100bp时，完全得不到菌落。如图4所示，随着同源臂长度的提高，转化后得到的菌落数也增加，当上下游同源臂达到1000bp时，最终转化会得到的菌落数是500bp的1.6倍，且得到的菌落全为正确的基因敲除。
51.实施例5.利用crispr/cas9系统可实现基因的替换
52.为了验证设计的crispr/cas9系统在pxo99a中是否可实现基因的替换，本发明中选择了将tatc基因替换为卡那霉素抗性基因进行检测。通过网站https://design.synthego.com/#/帮助设计无脱靶位点的sgtatc，相关的核苷酸序列如seq id no：31所示，构建所用正向引物为5
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tagccgtggttgctgtatcaggcc-3’(seq id no：32)，反向引物为5
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aaacggcctgatacagcaaccacg-3’(seq id no：33)。在tatc基因两端分别选取约500bp的片段进行扩增，(上游同源臂正向引物：5
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cgcggatccaagcaggaactggaacgcgaactcgag-3’，seq id no:34；上游同源臂反向引物：5
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gacattcatccggctgtttctcctggatcttg-3’，seq id no:35；下游同源臂正向引物：5
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tctggggttcgctcttcgtgcctgcgatcaatg-3’，seq id no:36；下游同源臂反向引物：5
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cccaagcttgacgctggcgctgttcgtgatg-3’，seq id no:37)，扩增反应体系见实例1。此外以质粒pk18mobsacb为模板，正向引物为5
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gagaaacagccggatgaatgtcagctactgggctatc-3’(seq id no:38)，反向引物为5
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gcacgaagagcgaaccccagagtcccgctc-3’(seq id no:39)，扩增1080bp的卡那霉素抗性基因，
扩增反应体系见实例1。通过融合pcr的方法将3个pcr扩增片段融合为总长度约2080bp的片段(相关的核苷酸序列如seq id no：40所示)，之后通过bamhi和hindiii酶切连接后构建到质粒pseva-sgtatc上，最终得到的质粒pseva-δtatc::kan用于以同源重组的方式实现基因的替换。
53.将质粒pseva-δtatc::kan电转入含有phm1-crispr质粒的pxo99a电击感受态细胞中，复苏后涂至含有壮观霉素、庆大霉素以及卡那霉素抗性的psa平板上。如图5b所示,培养3天后发现，转有pseva-δtatc::kan的含3种抗性的psa平板上有菌落产生，证明pseva-δtatc::kan确实实现了基因的替换。通过鉴定引物tatc-confirm-f(5
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gtcgtcgccctagtggtgctc-3’，seq id no：41)和tatc-confirm-r(5
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tgcctgaatctcgcactggcattg-3’，seq id no：42)进行pcr验证，野生型菌株扩增片段长度约1500bp，突变菌株扩增片段长度约1800bp。测序结果也证明了这一点。而转化pseva-sgtatc后，由于没有同源片段发生重组，因此得不到菌落。这一结果证明设计的crispr/cas9基因编辑系统在pxo99a中也可以实现基因的替换。
54.以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。