蛋白纯化系统应用之吸附层析

作者：张馨予

吸附层析是最早使用的一种层析方法，其基本原理是依据不同物质在同一吸附剂上的吸附能力的不同来进行分离。吸附层析可以是薄层层析，也可以是柱层析——即蛋白纯化系统使用的纯化方式。硅胶通常用于薄层层析——将不同颗粒度的硅胶用水调成糊状铺于玻璃板上，后经高温烘干。硅胶也可用于柱层析。硅胶主要是用于疏水性物质的分离，在蛋白质化学中不常使用，但可以用于小分子多肽的分离和分析。磷酸钙凝胶与硅胶相反，基本上只用于柱层析，主要用于蛋白质等大分子的分离，对某些酶类的分离呈现很好的效果。

吸附层析是最早使用的一种层析方法，其基本原理是依据不同物质在同一吸附剂上的吸附能力的不同来进行分离。这种吸附作用的本质多为基质和样品间的非专一偶极与偶极间的作用。将样品放入层析基质后，经展开，吸附能力差的蛋白质迁移得快，而吸附能力强的蛋白质移动得慢，从而可使一个混合物中的几种蛋白质按其吸附性的差异被彼此分开。常用的吸附剂有硅胶和磷酸钙凝胶等。

吸附层析可以是薄层层析，也可以是柱层析——即蛋白纯化系统使用的纯化方式。硅胶通常用于薄层层析——将不同颗粒度的硅胶用水调成糊状铺于玻璃板上，后经高温烘干。硅胶也可用于柱层析。硅胶主要是用于疏水性物质的分离，在蛋白质化学中不常使用，但可以用于小分子多肽的分离和分析。磷酸钙凝胶与硅胶相反，基本上只用于柱层析，主要用于蛋白质等大分子的分离，对某些酶类的分离呈现很好的效果。

吸附层析常用于浓缩样品。一些浓度很稀的样品，在特定的条件下吸附在层析柱上，而后突然地改变条件，将被吸附的样品一起从吸附柱上洗脱下来，这样所得的样品的浓度可以提高很多。

离子交换层析

这是蛋白纯化系统使用的最广泛的层析之一，原理是利用物质的电荷和层析载体的电荷间的相互作用达到分离纯化的目的，其本质也可归纳为吸附层析，只是吸附作用来自离子间的静电作用。离子交换层析所用的基质被称为离子交换树脂。根据所用树脂的电荷性质，这类层析又可以分为阳离子交换层析和阴离子交换层析。根据树脂上可电离基团的解离度，它们又可分为强和弱的离子交换树脂。通常吸附在强离子交换树脂上的物质要用较强的酸或碱洗脱，而多数蛋白质对酸碱不太稳定，所以对于蛋白质较多使用弱离子交换树脂。一些较小且较稳定的分子，如氨基酸和小分子多肽等，仍可用强离子交换树脂。另外，在测定结构时，无需考虑活性，则可任意选用，达到分离的目的即可。

用离子交换树脂进行生物分子分离时，pH是很重要的因素。对蛋白质或多肽类两性电解质而言，处于不同的pH, 所带的电荷不同。于是，在不同的 pH 和不同的离子强度下，蛋白质或多肽在不同的离子交换树脂上的吸附程度也不同。如果能选择适当的条件，会对蛋白质的分离纯化起到事半功倍的效果。以免疫球蛋白G (lgG) 的分离纯化为例, 它的等电点较高，故在较高pH和较低离子强度时，不能吸附在阴离子交换树脂上。用硫酸铵分级沉淀后，收集0~40%饱和度的沉淀，用pH= 8 左右的缓冲液（含约50mmol/L的NaCI) 溶解并透析，然后再用同样缓冲液平衡的DEAE 离子交换树脂，结果只有IgG没有吸附，其他的蛋白质几乎全吸附在柱上。

离子交换层析基本上是用于亲水物质的分离，其选用的树脂类型以及样品洗脱的条件可以对样品的带电行为提供一些信息。离子交换树脂价格相对低廉，因此广泛用于蛋白质等生物活性物质的制备。

另外，有层析聚焦技术（chromatofocusing) ，此类特殊的离子交换树脂商品名为聚缓冲液交换剂（poly buffer exchanger)。先用某一pH缓冲液平衡聚缓冲液交换剂，再用另一pH缓冲液平衡，就能在这种离子交换剂上建立一个pH 梯度。上样以后，用一种具有pH 梯度的聚缓冲液洗脱树脂时，被吸附样品中的蛋白质就能按照它们的等电点依次被洗脱。在这一过程中同时产生聚焦作用，致使各蛋白质分级变得很窄，样品高度浓缩，整个分离过程呈现出很高的分辨率。