荧光原位杂交（FISH）检测技术共识

作者：杨超月

骨组织及钙化病灶固定后，需要先将钙盐除去使组织软化，以便于后续的临床检测。传统的脱钙剂（盐酸）会显著降解DNA和RNA，无法保证荧光原位杂交检测结果的准确性，脱钙剂乙二胺四乙酸（EDTA）可以在脱钙过程中保护DNA，但脱钙时间会延长至48小时【5,6】。

四）组织脱水、透明、浸蜡

实验室需根据自身的实际情况，通过严格的测试，制定标准化的组织脱水、透明、浸蜡流程以及试剂更换程序。建议使用自动组织脱水机和梯度乙醇脱水方案，如70%乙醇→85%乙醇→95%乙醇×2→无水乙醇×2。根据处理的组织类型和大小以及脱水机的工作效率，每种梯度的乙醇作用时间可设定为60～120分钟。根据处理组织的数量和试剂使用时间及时进行更换，脱水时间不足或试剂更换不及时均会导致后续染色、杂交效果不佳。

五）组织切片

根据检测要求石蜡切片厚度为3～5μm，贴于阳离子或正电荷（或类似的）等专用防脱载玻片上，确保切片与载玻片间没有气泡。切片在空气中略微干燥后应立即烤片，推荐标准温度为65℃烤片不少于2小时。荧光原位杂交未染色的切片置于室温不宜超过6周【3,7】。

二、荧光原位杂交检测步骤

荧光原位杂交检测根据检测标本的不同，操作步骤略有差异，主要流程包括：预处理、变性/杂交、杂交后清洗等环节。荧光原位杂交新项目开展之前，应进行包括方法学及试剂等性能验证，建立符合实验室的标准化操作流程，以确保结果的准确性。

一）脱蜡

烤好的组织切片需经过脱蜡处理，二甲苯脱蜡不足会导致探针杂交强度和杂交效率降低、荧光背景高等，影响实验结果。因此脱蜡使用的二甲苯必须及时更换，通常至少每两周更换一次，并可根据实际情况延长脱蜡时间；脱蜡过程中产生的有机废物需进行回收处理【8-10】。

二）预处理/酶消化

1、切片预处理：在现阶段，预处理常见试剂有1mol/L硫氰酸钠、30%酸性亚硫酸钠、10mmol/L柠檬酸、去离子水等；处理方法有高温水浴、高温高压等；预处理温度50～120℃不等。处理程序会因组织类型不同而有差异。

2、酶消化处理：对切片进行酶消化，常用的蛋白水解酶有胃蛋白酶和蛋白酶K。不同批号、不同厂商的胃蛋白酶活性不同，消化能力也存在一定的差异。酶消化的作用是分解包围靶DNA的蛋白质，以增加探针与靶核酸结合的机会，提高杂交信号。酶消化注意事项：①酶的浓度过高、消化时间过长或孵育温度过高，会对细胞的结构有一定的破坏，细胞核消失或细胞核辨认不清，也会造成一定程度的组织脱片；②酶消化不足会造成蛋白消化不透彻，降低组织的通透性以及杂交信号的强度和杂交率；③消化酶均为现用现配，且工作液使用时间<24小时【11-13】。

3、梯度乙醇脱水：将组织切片依次置于70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2分钟脱水，自然晾干。注意事项：切片必须充分脱水晾干，避免造成信号减弱或者杂交失败。

三）探针的应用

1、探针的配制：国内常用的探针有即用型和非即用型，即用型探针可直接点样杂交，操作简便。非即用型探针是需要操作者将探针与杂交缓冲液按一定比例配制，配制方法参照探针厂商说明书。注意事项：①探针不宜反复冻融，可适当分装；②震荡旋涡时需轻柔；③充分混匀，如果混匀不均，会导致杂交信号微弱或无信号【3,8,9】。

2、探针的加样：参照选用厂商推荐或经过本实验室有效性验证纳入标准化操作流程文件的探针加样量，加到待杂交组织中央处，使用合适的盖玻片，橡胶水泥密封四边。注意事项：①探针的使用和配制遵照本单位选用试剂的产品说明书操作；②盖玻片一般采用硅化盖玻片或无菌的蜡膜；③注意环境光强度，避免太阳光或强烈的光照；④加盖玻片时注意不要留有气泡，避免因气泡造成干片现象，导致无杂交信号或杂交率降低；⑤盖玻片边缘封胶不严密也会出现干片现象。

3、变性及杂交：变性和杂交分为甲酰胺变性杂交（手工操作）和杂交仪变性杂交（自动操作）。前者是将组织切片和探针分开进行变性，后者是在杂交仪中对组织切片和探针共变性，此方法可以在一定程度上降低人为因素的影响。根据所选用厂家探针的要求，设定共变性杂交条件，可选变性温度和时间：72～95℃，3～5分钟，杂交温度和时间：37或42℃，16～18小时。注意事项：为避免杂交液在变性和杂交过程中的损失及防止干片，一定要在盖玻片的四周用橡胶水泥进行密封。