超全面的抗体应用知识

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

超全面的抗体应用知识

图 2.标准免疫沉淀法的流程示意图。

IP检测在许多细胞和分子生物学研究很受欢迎。根据其最基本的原理，IP常用来纯化目标抗原以进行后续研究。IP也常用于研究稳态细胞或经过特定处理的细胞中的各种蛋白质之间的相互作用。在通过IP研究蛋白质相互作用时，其中一个已知蛋白的抗体将用于免疫沉淀步骤，随后再可通过如免疫印迹法（见下文）来确定与这个已知蛋白结合并共同沉淀分离出来的另一种蛋白分子。

免疫吸附实验

酶联免疫吸附试验（ELISA）用来对一个特定的可溶性蛋白分子进行定性和定量分析，如血清，或液体的样品，如生物体液和细胞培养物上清液中的特异性抗体或蛋白质的有无及浓度。此方法是利用了聚苯乙烯检测板吸附蛋白质或抗体的能力及抗体特异性结合靶抗原的能力。一般来说，此方法可通过检测实验样品在一定波长下的吸光度，再结合已知的抗原或抗体浓度标准曲线，计算出检测样品中此抗原或抗体的浓度。有3种常用的ELISA检测方法。

直接ELISA法

直接酶联试验使用不同量化的单克隆抗体来确定溶液中的某种特定抗原的浓度。

例如，直接ELISA可通过测量细胞培养上清中的细胞因子含量从而确定此群细胞（经刺激或抑制处理）分泌细胞因子的水平。

直接ELISA法常以“三明治”法进行，即两种单克隆抗体通过不同的抗原表位结合在同一个靶抗原上，把靶抗原夹在中间。首先把“捕获”抗体包被在测定板上。然后在洗涤和封闭后，将待测溶液加入到测定孔中，让“捕获”抗体去捕获溶液中存在的靶抗原。洗去样品中其余的蛋白分子，在测定孔中加入偶联生物素“检测”抗体。再加入链霉抗生物素蛋白复合酶，以结合偶联生物素的检测抗体。最后，在测定孔中加入酶的显色底物。可以根据测定测定孔中的特定颜色变化进行相对定量: 颜色变化的越多，样品中的抗原浓度越高。可以通过已知靶抗原浓度的样品测定孔制作标准曲线，从而对未知浓度的样品测定孔进行绝对定量。这个检测过程不需要“捕获抗体”也可以进行；换句话说，抗原可直接包被到检测孔进行后续检测。但是，通过双抗体夹心法检测靶抗原其特异性更高（图3）。

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图 3.标准直接夹心ELISA法的流程示意图。

间接ELISA法

间接酶联试验是用来检测溶液中的抗原特异性抗体的含量。

在此项检测中，某种特定的抗原会直接包被到检测板的样品孔中。可能含有此种抗原特异性抗体的待检样品（如血清，杂交瘤细胞培养基）被加入到检测孔，特异性抗体抗原会相互结合。接下来，在检测孔加入可以结合抗体Fc段的酶联第二抗体，让它与已经结合在特异性抗原上的抗体相结合。最后，再加入比色底物，底物被第二抗体上偶联的酶酶解，通过吸光度的测定值反映所要检测抗体的含量。

竞争性ELISA法

竞争性酶联试验通常用来检测小抗原分子。

在此类检测中，把未知浓度的靶抗原样本加入到已包被了已知浓度的相同靶抗原的检测孔中。然后加入检测靶抗原的标记抗体。然后洗去可溶性的抗原抗体复合物，结合在检测孔中抗原上的抗体含量最后被检测到。竞争性ELISA法最后检测到的信号强度一般与其他ELISA方法相反。

具体说来，样品中游离的抗原浓度越高，就会结合越多的抗体，因此结合到检测板上固定抗原的抗体就会减少，因此最后检测到的信号就会越弱（图4）。

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图 4.竞争性ELISA法的流程示意图。

酶联免疫斑点法

酶联斑点类似于夹心ELISA法检测细胞因子或其他可溶性因子，是通过结合在检测板上的单克隆抗体来捕获把抗原，以及可以用于进行比色测定的酶联第二单克隆抗体检测捕获的靶抗原。但是不同的是，在酶联免疫斑点检测中，产细胞因子的细胞可直接培养在预先包被了捕获抗体和封闭过的检测板中，此检测可以从一个斑点中捕获单个细胞所分泌的细胞因子。培养特定的一段后，弃去检测板中的细胞。其余后续的检测步骤同普通ELISA法非常类似。只是最后一步不是通过检测某波长下的吸光度来分析，而在显微镜直接进行视觉观察或使用专门的读板器。成功检测产细胞因子细胞的ELISPOT法在每个检测孔中会出现很多颜色深浅不一的斑点，每个斑点对应一个单细胞。ELISPOT法特别适用于检测细胞数量非常少的细胞群，比如检测免疫小鼠的抗原特异性T细胞，此类数量非常少的细胞群用其他的方法一般很难检测到（图5）。

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图 5.酶联免疫斑点法。

A, 流程示意图。 B, 酶联免疫斑点法检测的代表性结果图。