Northern blot protocol

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

1.Total RNA isolation：
测定OD260，OD280及两者比值，换算出RNA的浓度。并电泳鉴定。
2.Gel：
以80ml的1.5％甲醛琼脂糖凝胶为例：
agrose：1.2g
dd H2O：57.6ml
10×RNB*(RNA buffer)：8ml（RNB具体配方见后，用*表示，下同）
甲醛溶液：14.4ml
3. Electrophoresis：
（1）加样：（以取20μg RNA为例）在0.5ml管中加20 μg RNA＋2－4倍RNA体积的SB溶液* ，votex，65℃热变性10min，立即上冰5min，微离心一下，加相应的10×loading buffer（大连宝生物公司taq酶系列会提供），混匀，准备上样。
（2）预电泳：在正式上样电泳前，在胶点样孔中各加一点10×loading buffer（加的孔数要超过正式电泳所用的点样孔）先看点样孔漏不漏，预电泳15－20min。此工作可在RNA变性时进行。这一方面可判断胶漏不漏，另一方面可使胶活化。
（3）正式电泳：将（1）步的混匀样全部加入点样孔，50V电泳4－5小时（电泳时间长短还要依你胶的大小而定，一般要使loading buffer跑到四分之三左右。
电泳最好在4℃冰箱里进行，并且要有循环器在电泳缓冲液两边进行交换，以防两端缓冲液PH相差过大。电泳缓冲液用1×RNB。
4.转膜：
（1）在转移槽内放好玻璃板，铺好滤纸桥，紧贴玻板。
（2）倒入转移液（20×SSC*），浸透滤纸桥，驱除气泡，同时按胶大小剪好合适的膜（膜为Amersham公司的Hybond－N＋膜）和两张同样大小的滤纸。
（3）将胶从加样孔先接触滤桥面，自一端将胶滑放至滤纸桥上，注意不留气泡。
（4）将膜放在胶上，小心慢速，自一端起紧贴胶面，检查及排除气泡，用一干净玻棒轻缓的在膜上滚几下以排除气泡。
（5）用保鲜膜在四周封边，在尼龙膜上放上两张滤纸片，再堆上5－8cm吸水纸堆，压上重物，10－24hr。
（6）转膜完毕，移去吸水纸，将膜取出，紫外交联（245nm1.5J/cm2照射膜1min45s）并标好膜的正面及加样顺序，将膜在6×SSC或2×SSC溶液中浸泡一下，纯水冲洗一下。
（7）用亚甲基蓝溶液浸泡摇晃染色3－5min，纯水摇床脱色，可见RNA电泳条带，标好28S，18S。
5.探针的标记：（下列物质除α-32P dATP购自Amersham公司，其余来自于Promega公司的labeling kit）
（1）取25－40ng的模板DNA（假设以1μL为例）于0.5ml管中，加11μL dd H2O,100℃变性5－10min，立即上冰5min。
（2）在冰上依次在管中加入：
                             BSA: 1μL
                             dNTP(-dATP):1μL
                             labeling 5×buffer: 5μL
                             klenow酶：1μL（5U/μL）
                             α-32P dATP(最后加) 5μL
                                   （合计：25μL体系）
振荡后放入铅盒，37℃ 1hr，加200μL dd H2O终止反应。可4℃短暂保存。
6.探针的纯化（sephades G－50柱层析法）：
   （1）1ml注射器底部用无菌玻璃棉填塞，加剪盖的0.5ml管放入体积较大的离心管中，注射器中装填用ＳＴＥ平衡的sephades G－50凝胶。
   （2）层析柱室温离心，1000g×2min，再重复步骤（1）（2），使注射器装满sephades G－50凝胶。
   （3）将标记好的探针滴加在层析柱上，离心，1000g×4min，收集0.5ml管中液体，即为纯化好的标记cDNA探针。

7. 杂交：
    （1）将膜反面紧贴杂交瓶，加入杂交液5ml左右，42℃预杂交 1－3hr。
    （2）换新杂交液2ml（杂交液体积应根据杂交瓶大小而定，必须使瓶平放时，杂交液铺满底部）将变性的探针（95－100℃10min，上冰5min）加入杂交液中，合适温度下杂交16hr左右。
8. 洗膜：
杂交完毕，倾去杂交液，用洗膜液*洗膜2－3次，一次1hr左右。
9. 压片：
      用灭菌清水漂洗，保鲜膜包好膜，避免气泡，置于暗盒，固定好，压上柯达X光片，－80℃放射自显影。（具体时间依monitor检测的强度而定）。
10. 冲洗照片，分析结果。
11. 煮膜：（用于洗去杂上的探针，以备后用）
       在烧杯中加入煮膜液*，将膜放入其中，最好反面紧贴烧杯壁，烧杯放在电炉或煤气炉上煮沸30－45min左右，清水漂洗后，用monitor检测有无信号，若还有，继续换煮膜液再煮一次，煮后最好压一张新片，以判断背景。

附：常用配方：

杂交液   0.2M PBS(PH7.2)→→ 200ml 1M PBS(PH7.2)
              1mM EDTA(PH8.0) →→ 2ml 0.5M EDTA(PH8.0)
              1% BSA         →→  10g BSA（最后加，不可加热和剧烈搅拌）
              7% SDS         →→  70g 固体SDS
              15% formamide  →→  150ml 甲酰胺
              dd H2O 补至 1000ml
   (1M PBS=57.7ml 1M Na2HPO4+42.3ml 1M NaH2PO4)
无需高压灭菌。（下同）但需装于棕色瓶中。