荧光报告系统的研究进展

作者：张馨予

“生物发光”现象很久以来不断地引起科学家们的好奇，它奇特瑰丽，却也相当普遍。在生物界里提到发光，人们首先想到的便是萤火虫，夏夜里星星点点的淡绿色光芒，令人心驰神往。深海中大约有90%的生物都有发光能力[], 如某些鱼类、藻类、贝类、珊瑚、蠕虫、水母以及细菌等。这种能力并非“花拳绣腿”，在阳光终年无法穿透的深海，一盏盏色彩各异的明灯在求偶、捕食、逃避敌害、信息交流等方面发挥着重要的作用。海洋以其稳定而广阔的生境和缺少光能的自然条件，为生物发光多样性的进化提供了可能[]。

生物发光是一种由荧光素酶催化的、以荧光素为底物的酶促反应。由于不同种类生物的发光系统在进化上有着不同的起源，因此编码荧光素酶的基因并不是同源的，荧光素也是一些不相关联的化合物[]。现阶段广泛应用的生物发光系统/基因主要是来源于水母的绿色荧光蛋白(GFP)、来源于昆虫的luc基因以及来源于发光细菌的lux基因。

几乎所有的发光细菌可归为三个属(发光杆菌属(Photobacterium); 弧菌属(Vibrio); 异短杆菌属(Xenorhabdus)[]，lux基因簇编码和调控细菌生物发光，利用这类基因构建的报告系统作为一种快速而经济的工具，在特定条件下不仅可以精确反映基因的实时表达量和细菌的生长速率[]，还可在基因组范围内检测启动子的活性[]。因其具有即时性和高灵敏度，在分子生物学、临床微生物及生化检测中呈现出潜在的应用价值。本文主要介绍了lux报告系统的分类及其各自的优缺点，综述了近年来该报告系统在环境监测、食品安全、新药发现等领域的部分研究成果，并对其应用前景进行了展望。

1 细菌生物发光的反应机制以及lux基因簇的组成

所有的发光细菌都具有生化上相似的发光系统，其反应机制为：在分子氧和荧光酶的作用下，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛(RCHO)氧化为FMN及长链脂肪酸(RCOOH)，并发射出波长为490nm的蓝绿光[]。细菌荧光素酶都由包含有α亚基(分子量为42kDa)和β亚基(分子量为37kDa)的异二聚体构成[]，仅当两亚基共存时荧光素酶才有活性。该酶反应的最佳温度为18℃，超过25℃即迅速失活[]。脂肪醛底物的供应是由脂肪酸还原酶作用于相应的脂肪酸，而还原态黄素单核苷酸可能是由依赖于NAD或NADP的氧化还原酶催化得来[]。

lux基因的表达发生在细菌生长的对数末期，并被生长过程中积累的一种物质(自诱导物)所诱导。该基因可以分成3部分:核心元件、附属元件以及调节元件。核心元件包括lux C、D、A、B、E()，其中luxA、luxB分别编码荧光酶的α和β亚基, 而luxC、luxD、luxE分别编码依赖NADPH的脂肪酸还原酶(54 kDa)、酰基转移酶(33 kDa)和ATP合成酶(42 kDa), 三者共同构成脂肪酸还原酶复合体, 产生长链脂肪醛作为发光反应的电子供体。lux基因的组成具有种属特异性，同一属间会因为菌株来源不同而造成基因组成上的差异。例如，大多数发光杆菌属在基因luxB、luxE之间存在附属基因luxF，但luxF并不存在于弧菌属和异短杆菌属的lux系统中。此外，所有海洋环境中分离得到的菌属(即：弧菌属、发光杆菌属)的lux操纵子下游均含有luxG基因，luxG在弧菌中编码一种在发光过程中产生的mRNA, 然而这类mRNA的功能未知，仍需进一步研究。哈氏弧菌(V. harveyi)中，基因luxG的下游还存在luxH。对luxG、luxH进行转座子插入致突变实验后，发现细菌的发光不受影响，由此推测这些基因可能与luxF相似，在细菌对海洋环境的适应性以及生存/共生等方面发挥着重要作用[]。

图 1 lux操纵子的结构简式 Figure 1 The structure of the lux operon

费氏弧菌中，luxC基因的上游含有两个调节基因：luxI和luxR。luxI与luxC、D、A、B、E同属于右操纵子，luxI的编码产物被证实是发光细菌的自诱导物因子合成酶。基因luxR属于左操纵子，其转录方向与luxI相反。luxR的编码产物被认为是自诱导物的受体[]，自诱导物-受体复合物随后会激发右操纵子的转录。

2 原核生物lux报告系统的分类

lux报告系统可应用于原核和真核生物中来得到报告菌株，本文主要介绍其在原核生物中的应用。大多数微生物的染色体上并不存在合成荧光素酶的基因，因此若想得到可发光微生物，必须转入控制合成荧光素酶的基因(luxA, luxB)和控制合成长链脂肪醛酸还原酶的基因(luxC, luxD, luxE)，这可以通过基因工程的手段来得到。由于某些细菌的基因会受到外界因素如抗生素、重金属、温度等影响而改变转录水平，因此，构建lux报告系统最常用的方法是将这些特定基因的启动子与lux基因相融合。目前，可以在原核生物中表达的lux报告系统主要有两种类型：以基因组为载体的lux报告系统和以质粒为载体的lux报告系统。

2.1 以基因组为载体的lux报告系统