活体成像研究底物之：Coelenterazine 腔肠素

作者：杨超月

活体成像研究底物之：

Coelenterazine 腔肠素（Rluc/Gluc报告基因）

— —活体成像研究/体外生物发光研究

搜索关键词：

Rluc 报告基因；Renilla Luciferase 海肾荧光素酶；Coelenterazine 腔肠素；D-Luciferin Sodium D-萤火虫荧光素钠盐；In vivo imaging 活体成像研究；双荧光素酶报告基因检测；CAS：55779-48-1；

基本描述：

腔肠素（Coelenterazine）是在水生生物中发现的一种发光基团（luminophore），是许多荧光素酶的作用底物，包括海肾荧光素酶（Renilla reniformis luciferase, Rluc），分泌型膜锚定荧光素酶（Gaussia luciferase, Gluc）和薮枝虫荧光素酶（Obelia luciferase），和发光蛋白包括水母发光蛋白（Aequorin）的构成之一。前者的作用原理是以腔肠素为底物的荧光素酶，在含分子氧的条件下，氧化腔肠素产生高能量的中间产物，在此过程发射蓝色光，光波长在450~480nm。不同于甲虫（或萤火虫）荧光素/荧光素酶（FLuc）系统不同，在含分子氧的条件下，还需要ATP和Mg2+的存在才能同时发光，光波长在550-570nm。由于生物发光信号和底物的差异，RLuc常常与FLuc联合用于多报告基因研究。后者的作用原理是由脱辅基水母发光蛋白(Apoaequorin, APO)，分子氧和腔肠素组成的复合物形成活化的水母发光蛋白（Aequorin），一旦与钙离子结合后，复合物结构被破坏，腔肠素被氧化生成高能产物（Coelenteramide），同时释放出CO2和蓝色光。

腔肠素应用甚是广泛，包括：1）活细胞或组织的钙离子检测；2）细胞或组织的超氧化物和过氧亚硝基阴离子（活性氧，ROS）化学发光检测；3）基因报告基因检测；4）动物活体检测；5）ELISA和生物发光共振能量转移（BRET）用于蛋白相互作用研究；6）药物高通量筛选（HTS）；

腔肠素的几个重要应用：

A、腔肠素/水母蛋白复合物用于钙离子检测（Coelenterazine/aequorin complex for calcium measurement）

A1、与传统荧光法钙离子浓度检测的优势

传统荧光法钙离子检测工具琳琅满目，由紫外光激发到可见光激发的钙离子检测，比如，Fura-2激发光比率型荧光探针，Fluo-8最亮的钙离子荧光探针，钙离子检测的灵敏度越来越高，也越来越方便，对仪器的要求也越来越低，那么腔肠素/水母蛋白系统对钙离子检测的优势在哪呢？

○ 钙离子/水母蛋白复合物（Ca2+/aequorin complex）能检测宽广范围的钙离子浓度，从~0.1μM到＞100μM。

○ 比荧光法探针的背景低，样本本身不会发生自荧光。

○ 虽然信号比荧光法低，但用成像仪能得到更高的信噪比。

○ 水母蛋白复合物（aequorin complex）不会从细胞内泄露出来，因此能监测几小时至数天内细胞钙离子（Ca2+）浓度变化。

A2、工作原理

由脱辅基水母发光蛋白(Apoaequorin, APO)，分子氧和腔肠素组成的复合物形成活化的水母发光蛋白（Aequorin），一旦与钙离子结合后，复合物结构被破坏，腔肠素被氧化生成高能产物（Coelenteramide），同时释放出CO2和蓝色光（~466nm）。

活体成像研究底物之：Coelenterazine 腔肠素

图1. 腔肠素/水母蛋白复合物用于钙离子检测的反应流程。

B、生物共振能量转移（BRET for assaying protein-protein interactions）

B1、工作原理

BRET是一种高级的、无破坏性和以细胞为基础的检测技术，极其适合蛋白组学研究，包括受体研究和信号转导途径的路线图。该技术是基于含生物发光荧光素酶和GFP变体融合蛋白之间的非放射性能量转移。

大部分应用中融合供体是海肾荧光素酶（RLuc），而不是水母发光蛋白（Aequorin），目的是为了避免对水母来源GFP突变蛋白的内源性亲和性。受体是黄色荧光蛋白（YFP），能够提高良种发射光间的光谱区分。当供体和受体靠近，对腔肠素衍生物底物催化降解后产生的能量从荧光素酶转移到YFP，从而使其释放自身的荧光。BRET比值的计算显示体内是否存在蛋白-蛋白相互作用，这种检测方法有效去除光输出波动可能造成数据的变动，比如由于反应体积、细胞类型、每孔细胞数目和/孔间信号延误等引起光输出波动。

B2、BRET与FRET相比的优势