翻译组研究技术进展

作者：张馨予

1 翻译组是蛋白组的最佳体现者

中心法则阐述了遗传信息从DNA通过转录为RNA，再经翻译合成蛋白质的基本生物学过程。信使RNA是蛋白质合成的信息蓝图，基于高通量测序的转录组测序技术（RNA-Seq）可以反映细胞中mRNA的种类和数量，并且还可以检测mRNA的序列变异和可变剪接[-]，因此RNA-Seq被广泛应用于研究基因的表达水平，揭示动植物的生长发育和逆境胁迫应答机理；尤其对基因组序列不太清楚的物种，可根据转录组序列推测蛋白质的序列，对于开发和利用这些物种起到了很大的推动作用。蛋白质是几乎所有生理过程的实际执行者，信使RNA到蛋白质的翻译过程受到转录后、翻译水平调控的影响，翻译后修饰和降解也会影响到蛋白质的丰度。因此，转录组测序只能反映基因是否转录生成RNA，不能反映mRNA是否被翻译成相应的蛋白质以及翻译水平。Maier等[]对多个物种的转录组和蛋白组进行比较研究后发现，mRNA水平与其编码蛋白质的量的相关系数R2的波动范围在0.01-0.5之间。因此，mRNA水平不能作为判断蛋白质水平的依据。

蛋白质组学的研究方法包括双向电泳、基于抗体的免疫学检测和质谱方法。双向电泳曾是蛋白组研究的主要技术，其利用等电点聚焦和SDS-PAGE相结合的方法将上千种不同的蛋白质依据其等电点（PI）和分子量的大小进行二维分离。该技术操作繁琐，重复性不高，难以检测到低丰度蛋白。此外，该技术对于难溶性蛋白及等电点极酸或极碱的蛋白的分离效果欠佳[]。而基于抗体的免疫学检测由于抗体只能识别蛋白质的特殊表位，和蛋白质特定序列相结合，因此抗体免疫学检测存在一定的局限性。

随着生物质谱技术的发展和不断成熟，质谱技术是目前蛋白组研究中发展最快、也最具活力和潜力的技术。其基本原理是蛋白质经胰蛋白酶消化后变成多肽片段混合物，在质谱仪中，具有不同质量与电荷比值（即质荷比，M/Z）的肽段分子被分开，经过检测器收集进而确定肽段的M/Z值。通过与蛋白质序列数据库中蛋白质经过胰蛋白酶消化后理论上产生的一级质谱峰图和二级质谱峰图进行比对即可鉴定蛋白质的种类和含量。质谱技术具有灵敏度高、快速、能同时提供蛋白质的鉴定、定量信息等优点[]。然而，质谱在蛋白质鉴定中也存在局限性，其解析度低，难以检测到低丰度的蛋白；蛋白质本身的物理和化学性质也会影响质谱检测，如疏水性膜蛋白、结构上对酶消化具有抗性的致密蛋白质、易于降解的蛋白质，则很难被检测到[]。此外，质谱法只能鉴定已知的蛋白质，对氨基酸序列非常相似的基因或同一基因不同剪切体产生的蛋白无法分辨，对新的或未知蛋白更是束手无策。

众所周知，蛋白质的合成需要通过翻译进行，由mRNA到蛋白质的翻译过程包括起始、延伸和终止3个阶段。大量研究表明起始阶段是蛋白质合成的主要限速步骤[-]。在起始阶段，核糖体40S小亚基首先识别mRNA 5' 端甲基化帽子，当mRNA与小亚基结合后，携带有甲硫氨酸的tRNA（tRNAMet）通过反密码子与mRNA中的首个AUG起始序列结合并进入核糖体，随后核糖体大亚基（60S）则与起始复合物相结合，形成完整的80S核糖体-mRNA起始复合物，肽链合成得以启动。在肽链合成过程中，其他核糖体还可以陆续结合到该mRNA上形成多聚核糖体（Polyribosomes，polysome）。翻译过程中核糖体-新生肽链复合物（Ribosome nascent-chain complex，RNC）中的mRNA即是能翻译成蛋白的mRNA，而没有形成复合物的mRNA，则无法被翻译成蛋白质。由此可见，翻译水平调控在蛋白质合成过程中的作用明显大于转录水平的调控。

RNA定量和测序技术非常完善，通过高通量测序技术对正处于翻译状态的mRNA（翻译组）进行研究，既可以间接反应蛋白质的翻译水平，又可以检测到基因的可变剪接甚至发现新的蛋白质分子。因此，翻译组是蛋白组的最佳体现者。研究翻译组还有助于更好地阐释从mRNA到蛋白质之间翻译水平调控机制研究。

2 翻译组研究常用技术

由于mRNA与核糖体的结合是一种非共价结合，多聚核糖体复合物构象非常脆弱，在细胞破碎过程中极易因为震动或环境变化而发生解离，因此翻译组研究难度较大，发展也相对滞后。多聚核糖体图谱技术（Polysome profiling）是研究翻译组的经典技术，近年来发展起来的翻译谱分析技术（RNC-RNA-Seq）、核糖体图谱技术（Ribosome profiling）、核糖体亲和纯化技术（Ribosome affinity purification，RAP）是研究翻译组的主要技术。

2.1 多聚核糖体图谱技术