提取蕨类植物蜈蚣草总RNA 的一种有效方法

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

何振艳徐文忠杨学习麻密②
(中国科学院植物研究所光合作用与环境分子生理学院重点实验室北京 100093)

摘要介绍了一种提取蕨类植物蜈蚣草(Pteris vittata L.)总RNA的有效方法。由于蜈蚣草富含多酚和多糖，用普通的RNA提取方法很难获得高质量的RNA。本方法通过优化提取缓冲液的条件来抑制多酚氧化，并利用RNA与多酚、多糖在不同浓度的2-丁氧乙醇中溶解度不同的特性来去除多酚和多糖。
本方法简便、快速，所提取的RNA质量较高，可直接用于cDNA合成、cDNA文库的构建以及RACE等分子生物学操作。
关键词蜈蚣草，蕨类植物，多酚，多糖，RNA提取

An Effective Method of Total RNA Isolation from a Fern Plant — Pteris vittata L.
HE Zhen-Yan XU Wen-Zhong YANG Xue-Xi MA Mi②
(Key Laboratory of Plant Photosynthesis and Molecular Environmental Physiology, Institute of Botany, the
Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093)
Abstract Here we reported on an effective method for total RNA isolation from a fern plant,Pteris vittata L. This method inhibits the oxidation of polyphenols by optimizing the conditions of the extraction buffer. Most of the polysaccharides and polyphenols extracted with nucleic acids are removed by taking advantage of differences in solubility of these compounds in the solvent 2-butoxyethanol. The whole process can be completed with a convenient manipulation in less than 2 hours. Isolated RNA has high purity and yield, and can be used for molecular manipulation such as the cDNA synthesis, cDNA library construction and RACE.
Key words Pteris vittata L., Fern, Polysaccharides, Polyphenols, RNA isolation

2001 年，《Nature》报道了世界上发现的第一种砷超富集植物(hyperaccumulator)——蜈蚣草(Pteris vittata L.)(Ma et al., 2001)。蜈蚣草属蕨类植物门、凤尾蕨科、凤尾蕨属，广布于我国长江以南各地区。最近越来越多的研究显示, 蜈蚣草和其他一些蕨类植物所具有的特性对于土壤砷污染的治理和植物砷抗性机制的研究都具有十分重要的意义(陈同斌等, 2002; Raab et al., 2004)。然而到目前为止，国内外尚无蜈蚣草砷抗性分子机制研究的报道。其他蕨类植物有关分子生物学的研究资料也很少。RNA提取是进行分子生物学研究的必要前提。由于蜈蚣草富含多酚和多糖，普通的RNA提取方法(如盐酸胍法和TRIZOL法等)很难获得高质量的RNA。在对多种RNA 提取方法进行比较和改进的基础上(Manning, 1991；Schneider et al., 1991；Sharma et al., 2003；Zhang et
al., 2003)，我们摸索出一种提取蕨类植物蜈蚣草总RNA 的有效方法。用该方法提取的RNA可直接用于cDNA 合成、cDNA 文库构建以及RACE 等分子生物学操作。

1 材料与方法
1.1 实验材料和试剂
蜈蚣草(Pteris vittata L.)采自我国湖北矿区，移栽在温室培养。取幼嫩叶片作为RNA提取材料。
各种试剂均为RNA实验专用。TRIZOL购于Invitrogen公司；Clontech PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit 和 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit 购于Clontech 公司。
1.2.1 改进的RNA提取法将0.5 mL 提取缓冲液(100 mmol.L-1 Tris-HCl, pH 8.3；500mmol.L-1 EDTA，500mmol.L-1 NaCl； 2%SDS; 5 mmol.L-1 DTT, pH 8.3)加入到1.5 mL离心管中, 加入1.5%(V/V)β - 巯基乙醇。将
100 mg新鲜的蜈蚣草叶片用液氮冷冻研磨后,迅速转到温浴的缓冲液中，剧烈震荡离心管，使组织与提取液充分混匀；70 ℃温浴6 分钟, 迅速置于冰上。待冷却后，12 000 g离心10 分钟，小心取出上清液；向上清液中加入0.1 mL 5 mol.L-1 NaCl，混匀后，加入1/2体积的水饱和酚和1/2体积的氯仿,在旋涡振荡器上剧烈振荡2 分钟， 12 000 g 离心10 分钟,小心取出上清液。向上清液中加入1/4体积的2-丁氧乙醇和1.5%(V/V)的β-巯基乙醇，混匀，冰浴10 分钟；12 000 g 离心10 分钟，小心取出上清液；向上清液中加入1 体积的2-丁氧乙醇和1.5%(V/V)β-巯基乙醇，充分混匀后静置10 分钟，12 000 g 离心10 分钟，倒掉上清液。用50% 的2- 丁氧乙醇洗涤沉淀2 次，加入适量的DEPC 处理水溶解RNA。
1.2.2 硫氰酸胍一步法提取总RNA 参考《分子克隆实验指南》的方法(Sambrook et al., 1992)。
1.2.3 TRIZOL法提取总RNA TRIZOL总RNA 提取试剂盒购于Invitrogen 公司，严格按照试剂盒说明书操作。
1.3 RNA质量检测
用紫外分光光度计检测RNA 纯度和浓度, 用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的完整性。
1.4 cDNA文库构建
以1.2.1节中所述方法分别制备经砷诱导的处理和对照的RNA，并构建差异表达的SSH(suppressive subtraction hybridization)cDNA文库(按试剂盒提供的方法操作)。合成的cDNA 质量可以验证RNA 的质量。

1.5 RACE
用1.2.1 节中所述的RNA 提取法制备的RNA进行RACE (rapid amplification of cDNA ends)实验(按试剂盒提供的方法操作)，对蜈蚣草ABC Transporter 基因进行克隆。以RACE 结果来验证RNA 的质量。

2 实验结果
2.1 RNA质量的检测
首先用琼脂糖凝胶电泳检测所制备的RNA 的质量。图1 中3~7 泳道为以1.2.1 节所述的改进方法提取的不同样本的蜈蚣草RNA。各个样本质量均一，28s rRNA 亮度高于18s rRNA或者与之相当, 说明提取过程中没有降解现象发生。在电泳检测中看不到DNA 污染,说明RNA 较纯净。

表1 为不同方法提取的蜈蚣草总RNA的纯度及含量。改进方法提取的蜈蚣草RNA 其OD260/OD280 为1.97 ± 0.01，说明RNA 纯度较高。硫氰酸胍一步法和TRIZOL法提取的蜈蚣草RNA有凝胶状沉淀，很难溶于水，其OD260/OD280分别为1.09 和1.03，表明RNA 不纯，有很多杂质，多酚多糖类去除不干净。电泳结果呈弥散状，无明显条带(图1 的1 和2 泳道)，表明RNA 已降解。

2.2 不同方法提取的RNA合成的cDNA比较
图2分别是不同方法提取的RNA合成的cDNA 电泳图。泳道1 是用改进方法(如1.2.1 节所述)提取的RNA合成的cDNA，其大小在0.5~2 kb 以上；而在凝胶检测中几乎看不到用硫氰酸胍法提取的RNA合成的cDNA以及用TRIZOL 法提取的RNA合成的cDNA。说明改进方法提取的RNA 质量高，有较高转录活性。