为什么PCR实验室要三区隔离？这样真的可以避免

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

在疫情期间我们总是能看见这样的报道，“病毒核酸检测出现“假阴性”？”“ 新冠病毒核酸检测出现假阴性到底是什么影响了准确率？ ”“为何新冠病毒核酸检测不断出现假阴性？”。

然而在平时的PCR实验室却经常出现“假阳性”的现象。PCR实验总是出现假阳性，明明没有加模板最后却扩出了产物。如果这种现象频频出现，就要注意一下操作环境了。

这里涉及一个气溶胶的概念，气溶胶是由固体或液体小质点分散并悬浮在气体介质中形成的胶体分散体系，能在空气中滞留至少几个小时。PCR反应过程中不断进行升温降温，液体蒸发又冷凝，PCR管中空气的部分形成了气溶胶，携带了大量DNA扩增产物（注意1ng扩增产物中可作为模板的DNA片段的数量超过1ng起始模板中可扩增DNA片段数量的几百万倍甚至更高。比如人的基因组DNA有30亿个bp，要扩增的单拷贝基因片段是300bp，1ng起始模板中可以作为模板DNA片段只占总起始模板DNA总量的千万分之一）。如果在实验室打开含PCR扩增产物的管盖，大量携带DNA扩增产物的气溶胶就会涌出，扩散到空气中，从而对环境造成污染。虽然在整个空间环境中DNA的含量很低，但是由于理论上只要有1个可做为模板的DNA片段也能PCR扩增成功，这就是为什么在污染环境中阴性对照也能扩增出条带的原因。

所以在专业的PCR实验（比如临床PCR检验实验室）室通常有四区隔离（或至少是三区隔离）的要求。

常见的三区指的是：

1、试剂配制区：PCR反应体系的配制区域。

2、标本处理区：包括扩增模板的制备，也就是我们常常提取DNA的地方；

3、PCR扩增和产物分析区：进行PCR扩增的区域，也是扩增产物进行凝胶电泳分析的区域。

如果将PCR扩增区域和产物分析区再次分开，就是四区隔离了。四区隔离，主要目的是防止气溶胶在各个PCR区域之间的流动—最好的方法是干脆每个区域隔一幢楼，那肯定是最佳的隔离措施了，但操作起来肯定不现实，于是便有了针对不同区域设置正负压的方法：

试剂配制区（Ⅰ区）：最洁净的区域，保持微正压使得外界空气无法进入隔

离污染源。并且阴性模板应该在此区加入PCR管并盖盖，严禁在此区域打开、存放装有DNA模板的离心管；

DNA模板添加区（Ⅱ区）：保持微负压，保证内部空气不外泄，以免阳性模板的气溶胶对外界环境造成污染；

扩增及PCR产物分析区（Ⅲ区）：保持微负压，使得内部空气不外泄，以免扩增产物的气溶胶对外界环境造成污染。

操作时遵循Ⅰ区→Ⅱ区→Ⅲ区单一方向进行，不可逆向进行。

对于科研用途的PCR实验室，如果无法达到严格的三区隔离的要求，至少也要做到两区隔离：即正压区和负压区。正压区实施Ⅰ区的功能，负压区实施Ⅱ区，Ⅲ区的功能。

最忌讳也是最可怕的是反过来，在正压区实施Ⅲ区的功能。我们有个用户的所有实验室都是正压—因为进入实验室的空气都是经过过滤的。他信心满满地认为他们的实验室超干净，做PCR绝对没问题，但他们实验室出现了最严重的PCR产物污染问题—所有的阴性对照都是阳性。所以PCR实验室的洁净度是次要的，不同区域间的空气是互相之间否有流通才是最关键的。

如果有的小伙伴问，我们的实验室没有正负压的区分，或者是全负压，全正压怎么办呢？那我们的建议是：别怕麻烦，找个远离Ⅲ区（通俗地讲就是打开PCR扩增产物的盖子区域，比如电泳区）的实验室当做PCR I区使用，能省掉后续更多的麻烦。

既然PCR三区隔离的目的是为了阻断气溶胶的交流，请注意以下细节，思考一下气溶胶来自哪里：

1. 每个区域都应配备专用的移液器，不可交叉混用。我们的一位用户拿电

泳室的移液器加模板，阴性对照扩出了很亮的条带。

2. 每个区域都应配备专用的移液器吸头，不可交叉混用。

3. 如果条件允许，在PCRⅢ区工作结束后再次进入PCR I区需要更换实验

服、一次性鞋套、帽子、手套。

4. 在PCR I区、PCRⅡ区配备带滤芯吸头。

很多做PCR的小伙伴会将做PCR的吸头灭菌、或者是在超净台做PCR操作。但在小析姐看来这完全没有必要，因为做好PCR最重要的是防止扩增产物的污染，而不是无菌操作！试想一下，高压灭菌了又如何，DNA并不会因此而降解多少，如果细菌的DNA会参与PCR扩增，那么无论活菌或是细菌尸体都一样能扩增出DNA条带。