一个挑起自噬与凋亡大梁的蛋白p62
今天要分析的题目为：Autophagy protein p62/SQSTM1 is involved in HAMLET-induced cell death by modulating apotosis in U87MG cells由题目可将文章由外向内一一拆卸开来。（回复170918可下载，一周有效）
第一部分也是主体的部分即HAMLET诱导U87MG细胞死亡；第二U87MG细胞死亡的过程是P62蛋白参与的；第三P62蛋白是通过细胞自噬和凋亡的形式参与的。那么就一起来看看p62蛋白是如何挑起自噬与凋亡的大梁的吧！
知识背景介绍
P62是众所周知的自噬蛋白，也称为SQSTM1蛋白，可在肿瘤细胞中发挥自噬与凋亡的作用。包括4个结构域，分别是PB1，TB，LIR，UBA。其中LIR结构域负责与自噬受体蛋白 Atg8/LC3结合。UBA结构域是可以招募泛素化蛋白，尤其是当蛋白被暴露在氧化剂和蛋白酶体抑制剂时。
HAMLET 是一种药物，能够诱导细胞死亡。
HAMLET能够在U87MG细胞中诱导细胞自噬
第一：HAMLET药物作用U87MG细胞后，MTS显示HAMLET处理的浓度越高细胞活性越低，处理时间越久细胞活性越低，表明HAMLET作用U87MG细胞具有剂量和时间依赖性。
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第二：探讨是否HAMLET是通过激活自噬途径促进细胞死亡。采用荧光GFP-LC3作为自噬小体的标记物进行免疫荧光染色单标实验，结果显示在HAMLET处理细胞3h时有55%的GFP-LC的标记，表明其激活了细胞自噬。
第三：电子显微镜结果显示HAMLET处理后，细胞双脂质膜层出现了自噬小体囊泡，表明在HAMLET200ug/ml作用后，细胞出现了自噬的现象。
HAMLET导致的u87MG细胞死亡与P62蛋白相关
第一：HAMLET作用U87MG细胞后观察P62蛋白的水平，蛋白结果表明其作用细胞后短暂增加了P62的蛋白表达水平。
第二：免疫荧光定位分析在HAMLET处理100ug/ml和200ug/ml时，GFP-LC3和P62蛋白共同定位与细胞中。
如何验证HAMLET诱导的U87MG细胞发生自噬
为了探索是否自噬是因为HAMLET诱导的细胞毒性引起的，课题组使用了Atg5、3MA、EBSS、雷帕霉素细胞自噬抑制剂进行一一验证，如下:
在U87细胞中敲减Atg5后，HAMLET处理200ug/ml后，P62的蛋白水平升高，但是细胞活性下降达到13%。
在U87细胞中敲减3MA后，HAMLET分别处理100ug/ml和200ug/ml后，增加了P62的蛋白水平，但是降低了细胞活性分别达到14%和40%。
在U87细胞中使用EBSS饥饿以后，HAMLET处理200ug/ml后，增加了P62的蛋白水平，降低了细胞活性达到63%。
当用2.5mmol/l 雷帕霉素处理后减少了P62的蛋白水平，HAMLET处理后，而且细胞活性增加达到12-16%。
P62蛋白水平变化对HAMLET诱导细胞自噬的影响
既然已经发现HAMLET能够诱导细胞发生自噬，而且P62蛋白参与其自噬的过程，那么P62蛋白水平的变化会影响到HAMLET诱导细胞自噬的程度吗？
第一：课题组设计了过表达和敲除P62蛋白的质粒转染入U87细胞，检测在用HAMLET处理观察其药物毒性的变化。结果表明敲除P62组削弱了HAMLET药物的毒性，过表达P62组增强了HAMLET药物的毒性。
第二：将U87细胞转染GFP标记的P62蛋白，然后用HAMLET药物处理1.5h后，结果发现HAMLET增加了细胞间的P62蛋白集聚。
HAMLET诱导CASPASE8调节胶质瘤细胞U87发生凋亡
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