非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体、重组植物

作者：张馨予

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体、重组植物乳酸菌及其制备方法和应用。

背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.非洲猪瘟(asf)是由非洲猪瘟病毒(asfv)引发的急性、高度接触性、烈性传染病，死亡率高。由于目前仍未有有效商品化疫苗、特效药物对该疫病进行预防、治疗，非洲猪瘟病毒在宿主间传播过程中发生变异导致最近出现毒力变弱新毒株，病症轻且潜伏期长，一旦感染短期发现相对困难，非瘟疫情防控形势仍然复杂。
4.目前针对非洲猪瘟疫病预防的研究已有多种疫苗形式，但asfv不同于其他核质大病毒之处在于其具有多层结构和整体二十面体形态，免疫生物学具有许多未知特征，有关感染性病毒粒子的组成和结构以及负责识别和诱导保护性免疫反应的病毒蛋白方面的知识差距很大，这就阻碍了有效疫苗的开发。研究发现asfv p54、p30、cd2v、p12、p17和p72等结构蛋白参病毒与对宿主吸附和内化作用，并且p54蛋白位于asfv病毒颗粒脂类外膜上，通过与动力蛋白轻链结合控制宿主细胞内的运输功能，在病毒感染过程中发挥重要作用，此外这些结构蛋白具有较好的免疫原性和保守性，能诱导中和抗体的产生和抑制病毒的内化作用，p54和p30蛋白已被作为asfv疫苗的主要候选抗原。尽管有报道杆状病毒载体或痘苗病毒载体表面展示p54和p30抗原免疫可延迟asf临床症状的发生，还能降低血液和淋巴组织中的病毒基因组载量，同时免疫后的仔猪可在e75毒株的攻击下存活，但是却不能抵抗高致病性基因型毒株的攻击。
5.分子流行病学研究表明传入中国的非洲猪瘟病毒属基因ⅱ型，研究能够用于ii型asfv毒株预防的疫苗显得尤为重要。非洲猪瘟病毒可以编码上百种蛋白，其中e120r基因编码的结构蛋白p14.5被鉴定为该病毒的关键毒力因子和晚期表达蛋白，并能够引起机体产生体液免疫。传统的疫苗方法，如灭活病毒，已被证明是无效的。更多成功的是通过自然衰减分离物或修饰活病毒。然而，一般只针对同一基因型的同源菌株有保护作用，对异源病毒的感染无效。此外，减毒活株往往有相关的副作用，如皮肤病变和关节肿胀，无法作为安全的疫苗使用。活病毒疫苗也可能导致慢性或持续感染，并有毒力返强的风险。减毒活疫苗的另一个问题是缺乏稳定的生产细胞系，因为asfv优先在原代单核或巨噬细胞中复制。
6.asfv主要通过仔猪消化道和呼吸道感染其黏膜部位，其中消化道黏膜被认为是asfv主要感染部位。发明人发现，尽管非洲猪瘟病毒以气溶胶或直接接触的形式进行传播并感染宿主黏膜，但asfv侵入黏膜屏障具体机制并不清楚，并且通过黏膜系统递送抗原的免疫途径来保护仔猪阻断非洲猪瘟病毒感染是否有效值得深入研究。

技术实现要素：

7.针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体、重组植物乳酸菌及其制备方法，本发明一方面以食品级植物乳杆菌l.plantarum nc8为出发菌株，以asfv基因ii型sy-18强毒株序列为基础，根据保护性抗原位点的研究，将相关的保护性抗原位点片段与猪源免疫球蛋白igg fc片段、硫酸乙酰肝素多糖配体多肽串联，并按照植物乳杆菌密码子偏好进行优化，从而成功构建获得nc8-psip-pgsa
’‑
p54-fc-p30-egp(nc8-psip409-ppfpp)菌株。经试验研究证明，本发明获得的重组植物乳杆菌能高效表达p54/p30抗原蛋白，具有良好的免疫原性。同时与原始菌株l.plantarum nc8相比，能诱导黏膜免疫、细胞免疫和体液免疫应答，具有良好的实际应用价值。
8.本发明的另一方面，选用非洲猪瘟病毒编码p14.5蛋白的e120r基因以及鼠源的il-33和一种基于霍乱毒素(ct)的酶活性cta1亚单位和金黄色葡萄球菌蛋白a的d域二聚体人工构成的佐剂cta1-dd构建三株新功能型重组植物乳杆菌，nc8-plp-s-p14.5，nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus和nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d，研究结果证实了本发明的重组植物乳杆菌通过口服方式饲喂小鼠后，小鼠在体液免疫、细胞免疫以及黏膜免疫方面的提升效果。
9.为了实现上述目的，本发明的技术方案如下所述：
10.在本发明的第一方面，提供一种非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体，所述重组表达载体包含p54、fc、p30和egp基因片段；
11.其中，p54与p30为非洲猪瘟病毒基因ii型sy-18毒株中编码参与对宿主吸附和内化作用相关的胞膜结构蛋白基因序列；所述fc为猪源igg3 fc基因序列，egp为肠道细胞hspgs受体靶向配体多肽序列。
12.在一种或多种实施方式中，所述重组表达载体为p54-fc-p30-egp(pfpp)；
13.具体地，上述p54、fc、p30和egp基因片段通过与pgsa’基因串联表达，p54-fc-p30-egp核苷酸序列如seq id no.1所示；
14.更进一步地，p54-fc-p30-egp编码蛋白其氨基酸序列如seq id no.2所示。
15.在本发明的第二方面，提供一种重组乳杆菌，所述重组乳杆菌转化有上述非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体。
16.为提高上述外源基因编码蛋白在重组植物乳杆菌载体表面呈递外源抗原作用，本发明的重组乳杆菌利用pgsa’基因片段，通过枯草芽孢杆菌膜蛋白pgsa’锚定的表面展示抗原的psip409为表达载体。
17.因此，本发明的具体实施方案其中之一，所述重组乳杆菌包含pgsa’锚定的p54、fc、p30和egp基因片段。
18.在一种具体的实施方式中，所述重组乳杆菌为nc8-psip409-pgsa
’‑
pfpp。
19.在本发明的第三方面，提供一种上述重组乳杆菌的构建方法，所述构建方法包括：
20.s1、将p54、fc、p30和egp基因片段插入锚定表达载体psip409-pgsa’中，构建重组表达载体p54-fc-p30-egp；
21.s2、将步骤s1的重组表达载体转入植物乳杆菌中即得。
22.在一种具体的实施方式中，步骤s1中，p54-fc-p30-egp的核苷酸序列如seq id no.1所示；p54-fc-p30-egp编码蛋白其氨基酸序列如seq id no.2所示；
23.在一种具体的实施方式中，步骤s2中，所述植物乳杆菌具体为植物乳杆菌nc8。
24.在本发明的第四方面，提供一种非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体，所述非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体为：plp-s-p14.5，plp-s-p14.5-il-33和plp-s-cta1-p14.5-d-d；
25.其中，p14.5为非洲猪瘟病毒编码p14.5蛋白的e120r基因序列；il-33为鼠源的il-33基因序列；cta1-dd为：基于霍乱毒素(ct)的酶活性cta1亚单位和金黄色葡萄球菌蛋白a的d域二聚体人工构成的佐剂cta1-dd基因序列；
26.优选地，plp-s-p14.5的核苷酸序列如seq id no.3所示；
27.plp-s-p14.5-il-33的核苷酸序列如seq id no.4所示；
28.plp-s-cta1-p14.5-d-d的核苷酸序列如seq id no.5所示；
29.进一步优选地，plp-s-p14.5编码蛋白其氨基酸序列如seq id no.6所示；
30.plp-s-p14.5-il-33编码蛋白其氨基酸序列如seq id no.7所示；
31.plp-s-cta1-p14.5-d-d编码蛋白其氨基酸序列如seq id no.8所示；
32.在一种具体的实施方式中，所述非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体的构建方法为：
33.选取编码p14.5蛋白基因(e120r)序列，同时将两种佐剂序列il-33和cta1-dd优化后分别置于e120r基因5'3'端(cta1-dd)与3'端(il-33)，p14.5，cta1-p14.5-d-d，p14.5-il-33-mus序列合成后插入以erm为筛选标记单锚定表达载体plp-s中，得到三个非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体plp-s-p14.5，plp-s-p14.5-il-33以及plp-s-cta1-p14.5-d-d。
34.蛋白p14.5在感染后期合成，位于病毒工厂中，是病毒粒子从病毒工厂转移到质膜时所必需的蛋白质，与蛋白p72相结合共同组成病毒的衣壳，并可以引起机体产生体液免疫。有研究认为蛋白p14.5可能在asfv dna的包埋过程中起作用。
35.疫苗佐剂是能够非特异性地改变或增强机体对抗原的特异性免疫应答、发挥辅助作用的一类物质。佐剂能够诱发机体产生长期、高效的特异性免疫反应，提高机体保护能力，同时又能减少免疫物质的用量，降低疫苗的生产成本；cta1-dd是一种基于霍乱毒素的酶活性cta1亚单位和金黄色葡萄球菌蛋白a的d域二聚体人工构成的佐剂，这种分子是无毒的，是一种安全的佐剂。它能够刺激强大而平衡的cd4
+
t细胞反应，极大地增强特异性抗体的产生；在全身免疫和黏膜免疫后，可以有效地成熟在外周淋巴结中的fdcs(滤泡树突状细胞)，增加生发中心b细胞和tfh的反应。
36.il-33是一个多功能基因，在细胞发生损伤时分泌，在调节免疫中发挥作用，可以与dc直接反应，刺激幼稚t细胞向th2或辅助性t细胞的分化；研究证明，在病毒感染期间，il-33可以通过促进nk和nkt细胞的扩张以及增强th1和cd8
+
t细胞应答，来帮助清除病毒。
37.s-层蛋白为细胞最外侧表面的单分子晶状结构蛋白，在许多古细菌中被认为是细胞膜的最外层结构，利用此蛋白表面展示外源蛋白；源于自乳酸杆菌的s-层蛋白不但具备在锚定表达外源蛋白的能力，还具有粘附特性，也可以作为刺激机体产生免疫应答的佐剂。
38.在本发明的第五方面，提供一种重组植物乳杆菌，所述重组植物乳杆菌为转化有第一方面所述非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体，所述重组植物乳杆菌包括：nc8-plp-s-p14.5，nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus和nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d。
39.在本发明的第六方面，提供一种第二方面所述重组植物乳杆菌的构建方法，所述构建方法包括：
40.s1、将p14.5基因、il-33和佐剂cta1-dd基因片段插入以erm为筛选标记单锚定表达载体plp-s中，构建重组表达载体plp-s-p14.5，plp-s-p14.5-il-33以及plp-s-cta1-p14.5-d-d；
41.s2、获得植物乳杆菌nc8感受态；
42.s3、将步骤s1的重组表达载体电转化至s2得到的物乳杆菌nc8感受态中即得。
43.在本发明的第七方面，提供一种菌剂，其包括上述重组植物乳杆菌或其发酵物或其代谢产物；
44.所述菌剂为液体或固体，优选为固体，进一步优选为冻干粉剂。
45.本发明所述的代谢产物包括菌体胞内代谢产物和/或胞外代谢产物。
46.术语“发酵物”用于指代发酵产品。相应的发酵物可以是从发酵培养重组植物乳杆菌的过程获得的液体，因此，也可称为发酵液；液体可以含有细菌(菌体)，但并不必然需要含有细菌。液体优选的含有由本发明的重组植物乳杆菌细菌产生的代谢物。
47.以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离，去除菌体细胞时所剩余的液体为“上清液”(在本发明的实施方式中，上清液被标记为cfs)，并且在本发明中，上清液内含有本发明重组植物乳杆菌的胞外代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该上清液。
48.以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离获取菌体，菌体可进行破碎获取菌体破碎物，破碎方式可以为超声(比如冰浴超声破碎细胞)或者本领域已知的其他手段，或者，更进一步的，对该菌体破碎物离心收集上清液，该上清液记为无细胞提取物，并且在本发明中，该菌体破碎物或无细胞提取物内含有本发明重组植物乳杆菌的胞内代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该菌体破碎物或无细胞提取物。
49.在本发明的第八方面，提供一种上述重组植物乳杆菌和/或所述菌剂在制备抗病毒产品中的应用。
50.所述重组植物乳杆菌和/或所述菌剂可以提高肠道对重组乳酸菌递送asfv抗原蛋白的吸收作用，进而诱导高效黏膜免疫应答反应。
51.在本发明的第九方面，提供一种抗病毒产品，其特征在于，所述抗病毒产品包括上述重组植物乳杆菌和/所述菌剂；
52.优选的，所述产品为动物疫苗、饲料添加剂或饲料；
53.进一步优选的，所述动物疫苗为猪疫苗，所述疫苗剂型可以为口服冻干粉剂；
54.所述病毒包括非洲猪瘟病毒(asfv)。
55.1.p54-fc-p30-egp核苷酸序(seq id no.1)
56.atggatagtgaattttttcaaccggtttatccgcgtcattatggtgaatgtctgagtccggttacgacgccgaacttttttagtacgcacatgtataccattctgattgcgattgttgttctggttattatcattatcgttctgatttatctgtttagtagtcgtaaaaagaaagcggcggccattgaagaggaagatattcaatttattaatccgtatcaag
atcaacaatgggttgaagttacgccgcaaccgggtacgagtaaaccggcgggtgcgacgacggcgagtgttggtaagccggttacgggtcgtccggccacgaatcgcccggcgacgaataaaccggttacggataatccggttacggaccgtctggtgatggccacgggtggcccggcggccgcgccggcggccgcgagtgcgccggcccatccggcggaaccgtatacgacggtgacgacgcagaatacggcgagtcaaacgatgagtgcgattgaaaatctgcgtcaacgtaatacgtatacgcataaagatctggaaaatagtctgggtagtggtggtggcggtagtggtggcggtggtagcggtagtgacattgaaccgccgacgccgatttgtccggaaatttgtagttgtccggcggcggaagttctgggtgcgccgagtgtttttctgtttccgccgaaaccgaaagatattctgatgattagtcgtacgccgaaagttacgtgtgttgtggttgatgttagtcaagaagaagcggaagttcaatttagttggtatgttgatggtgttcaactgtatacggcgcaaacgcgtccgatggaagaacaatttaatagtacgtatcgtgttgttagtgttctgccgattcaacatcaagattggctgaaaggtaaagcgtttgcgtgtgcggttaataataaagatctgctgagtccgattacgcgtacgattagtaaagcgacgggtccgagtcgtgttccgcaagtttatacgctgccgccggcgtgggaagaactgagtaaaagtaaagttagtattacgtgtctggttacgggtttttatccgccggatattgatgttgaatggcaaagtaatggtcaacaagaaccggaaggtaattatcgtacgacgccgccgcaacaagatgttgatggtacgtattttctgtatagtaaactggcggttgataaagttcgttggcaacgtggtgatctgtttcaatgtgcggttatgcatgaagcgctgcataatcactatacgcaaaaaagtattagtaaaacgcaaggtaaagaagcggccgcgaaagaagccgcggcgaaagaagcggcggccaaggaagccgcggcgaagatggattttattctgaatattagtatgaaaatggaagttatttttaaaacggatctgcgtagtagcagtcaagttgtttttcatgcgggtagtctgtacaattggtttagtgttgaaattattaatagtggtcgtattgttacgacggcgattaaaacgctgctgagtacggttaaatatgatattgttaaaagtgcgcgtatttatgcgggtcaaggttatacggaacatcaagcgcaagaagaatggaatatgattctgcatgttctgtttgaagaggaaacggaaagtagtgcgagtagtgaaaatattcatgagaaaaatgataatgaaacgaatgaatgtacgagtagttttgaaacgctgtttgaacaagaaccgagtagtgaagttccgaaagatagtaaactgtatatgctggcgcaaaaaacggttcaacatattgaacaatatggtaaagcgccggattttaataaagttattcgtgcgcataattttattcaaacgatttatggtacgccgctgaaagaagaggaaaaagaagttgttcgtctgatggttattaaactgctgaagaaaattaacttttttctgacgtatattggtagtggtggtggcggtagtggtagtaaacgtaaaaagaaaggtaaaggtctgggtaaaaaacgtgatccgtgtctgcgtaaatataaa
57.2.p54-fc-p30-egp氨基酸序列(seq id no.2)
58.mdseffqpvyprhygeclspvttpnffsthmytiliaivvlviiiivliylfssrkkkaaaieeediqfinpyqdqqwvevtpqpgtskpagattasvgkpvtgrpatnrpatnkpvtdnpvtdrlvmatggpaaapaaasapahpaepyttvttqntasqtmsaienlrqrntythkdlenslgsggggsggggsgsdiepptpicpeicscpaaevlgapsvflfppkpkdilmisrtpkvtcvvvdvsqeeaevqfswyvdgvqlytaqtrpmeeqfnstyrvvsvlpiqhqdwlkgkafacavnnkdllspitrtiskatgpsrvpqvytlppaweelskskvsitclvtgfyppdidvewqsngqqepegnyrttppqqdvdgtyflysklavdkvrwqrgdlfqcavmhealhnhytqksisktqgkeaaakeaaakeaaakeaaakmdfilnismkmevifktdlrsssqvvfhagslynwfsveiinsgrivttaiktllstvkydivksariyagqgytehqaqeewnmilhvlfeeetessassenihekndnetnectssfetlfeqepssevpkdsklymlaqktvqhieqygkapdfnkvirahnfiqtiygtplkeeekevvrlmvikllkkinffltyigsggggsgskrkkkgkglgkkrdpclrkyk
59.3 p14.5核苷酸序列(seq id no.3)
60.atggctgattttaattcacccatacaatatctcaaagaagactctcgcgatcgtacctcgatcggcagcttggaatatgatgaaaatgcagatacgatgattccgagctttgcggcgggtctggaagagttcgagccgattccagactacgacccgaccacgtccacctccctttacagccagctgacccataacatggaaaagatcgccgaggaggaggactctaacttcctgcatgatacccgtgaattcacttcattggttccggacgaggcggacaacaagccggaagatgatgag
gaaagcggtgctaaaccgaaaaagaagaagcacctgtttccgaagctgagcagccataaaagcaaa
61.4 p14.5-il-33-mus核苷酸序列(seq id no.4)
62.atggctgattttaattcacccatacaatatttgaaggaggacagcagagatcgtacctccatcggtagcctggagtatgatgagaacgccgacacgatgattccgagctttgcggctggtctggaagagttcgagccgattccggattacgacccaacgacctccacctccctgtatagccaactcacccataatatggaaaagatcgccgaagaggaggactctaacttcctgcacgatacgcgtgaattcacctctttagttccggatgaggcggataataagccggaagacgacgaagaaagcggtgctaaaccgaagaagaagaagcacctgtttccgaaactgagctcccataaaagcaaaggttctggcggtggcggctctggcggcggcgggtcaggttccatgcgtccgcgtatgaaatactccaatagcaagattagcccggcgaaattcagcagcactgccggtgaacgtagcgtcccaccgtgcaaaatccgccgtagtcagcagaaaaccaaagagttctgccatgtttactgcatgcgcctgcgctcgggcctgaccattcgtaaagaaacctcttacttccgcaaagagccgactaagcgctactcccttaaaagcggtaccaaacatgaagagaactttagcgcatatccgcgtgatagccgtaagcgcagcttgctgggttctatccaagcgtttgcggcgagtgtggataccctgtcgatccagggtacatcgttgctgacccagagcccggcgagcttatctacctataacgaccagagcgtcagcttcgttttggagaacggttgttatgtgatcaacgtggacgattccggcaaggaccaagaacaagatcaagtgttgctgcgttactatgaaagcccgtgcccggcttcgcaaagcggtgatggtgtggacggcaaaaagctgatggttaatatgagcagcatcaaggacaccgacatctggctgcatgcaaacgataaagactactctgtggaactgcagcgtggtgatgttagcccgcctgaacaggcgttttttgtacttcacaaaaagagctcagattttgtgtccttcgagtgcaagaacttgccgggtacgtacattggtgttaaagacaaccagctggctctggttgaagagaaggacgagagctgtaataatattatgttcaaactgtcgaaaatt
63.5 cta1-p14.5-d-d核苷酸序列(seq id no.5)
64.atgaatgatgacaaactatatagggctgatagccgtccgccagatgagatcaaacaatctggtggtctgatgccgcgcggtcagtccgaatacttcgatagaggaacccagatgaacattaacctgtacgaccacgcgacccagaccggttttgtgcgtcatgatgatggctacgtcagcacttctattagcttacgtagcgcgcatttggttggtcaggaggttagcgcgctgggtggtatcccgtatagccagatctatggttcgtaccgcgtgcattttggtgttctggacgaacagctgcatcgtaaccgtggttatcgttattactctaacctcgacatcccgccggcggccgacggctacggcctagcgggtttcccgccggagcaccgcgcatggcgccaggagccgtggattcaccatgctccgccaggttgcggtaatgccccacgtagcagcggctctggcggcggtggctcaggcggtggcggtagcggttctatggctgacttcaacagcccgatccagtatctgaaagaagactctcgcgatcgtacctcgatcggttcattggaatatgatgagaatgccgatactatgatcccgagctttgcagcgggcctggaagaatttgaaccgattccggattatgatccgaccacctcgacgtcactttacagtcaactgacccataatatggaaaaaatcgctgaagaggaggattccaactttctgcacgatacgcgtgagttcaccagccttgttccggacgaggctgacaacaaaccggaggacgacgaggaaagcggcgcaaaaccgaaaaagaagaagcatctgtttccgaaactgagcagccacaaaagcaagggttccggtggcggtggtagcggcggcggtggctctgggagcgccgacgcacagcagaataatttcaacaaggaccaacaaagcgcgttttacgaaattttgaatatgccgaatttgaatgaggcgcaacgcaacggcttcatccagtccttgaaagacgatccgtcccagagcaccaacgtgttgggtgaggcgaaaaagctgaatgagtcccaagcgcccaagggcagcggtggcggcggttccggtggaggcggcagtgggagcgctgatgcgcagcaaaacaacttcaacaaagaccaacagtctgcgttctacgaaattctgaacatgccgaacctgaacgaagcacagcgtaatggtttcattcaaagcctgaaggacgacccgagccaatctacgaacgtgctgggcgaagccaaaaagctgaacgagagccaagcgcctaag
65.6 p14.5氨基酸序列(seq id no.6)
66.madfnspiqylkedsrdrtsigsleydenadtmipsfaagleefepipdydpttstslysqlthnmek
iaeeedsnfl hdtreftslvpdeadnkpeddeesgakpkkkkhlfpklsshksk
67.7 p14.5-il-33-mus氨基酸序列(seq id no.7)
68.madfnspiqylkedsrdrtsigsleydenadtmipsfaagleefepipdydpttstslysqlthnmekiaeeedsnflhdtreftslvpdeadnkpeddeesgakpkkkkhlfpklsshkskgsggggsggggsgsmrprmkysnskispakfsstagersvppckirrsqqktkefchvycmrlrsgltirketsyfrkeptkryslksgtkheenfsayprdsrkrsllgsiqafaasvdtlsiqgtslltqspaslstyndqsvsfvlengcyvinvddsgkdqeqdqvllryyespcpasqsgdgvdgkklmvnmssikdtdiwlhandkdysvelqrgdvsppeqaffvlhkkssdfvsfecknlpgtyigvkdnqlalveekdescnnimfklski
69.8 cta1-p14.5-d-d氨基酸序列(seq id no.8)
70.mnddklyradsrppdeikqsgglmprgqseyfdrgtqmninlydhatqtgfvrhddgyvstsislrsahlvgqevsalggipysqiygsyrvhfgvldeqlhrnrgyryysnldippaadgyglagfppehrawrqepwihhappgcgnaprssgsggggsggggsgsmadfnspiqylkedsrdrtsigsleydenadtmipsfaagleefepipdydpttstslysqlthnmekiaeeedsnflhdtreftslvpdeadnkpeddeesgakpkkkkhlfpklsshkskgsggggsggggsgsadaqqnnfnkdqqsafyeilnmpnlneaqrngfiqslkddpsqstnvlgeakklnesqapkgsggggsggggsgsadaqqnnfnkdqqsafyeilnmpnlneaqrngfiqslkddpsqstnvlgeakklnesqapk
71.本发明的具体实施方式具有以下有益效果：
72.一方面，构建两株重组植物乳酸菌nc8-psip409-pgsa
’‑
pfpp与nc8-psip409-pgsa
’‑
pmfpp，对小鼠进行了口服灌胃免疫实验，对比pbs以及nc8组，免疫一周后，检测重组植物乳酸菌免疫后对小鼠细胞免疫的影响，结果显示两种重组植物乳酸菌均可以诱导小鼠脾脏产生cd4
+
il-4
+
和cd8
+
ifn-γ
+
细胞，表明重组植物乳酸菌表达的融合蛋白作为诱导机体细胞免疫的抗原，成功诱导了t淋巴细胞的反应，可能两个t细胞亚群均起到保护作用；
73.使用流式细胞术检测了重组植物乳酸菌免疫后小鼠派尔集合淋巴结b细胞中iga的含量，结果显示重组植物乳酸菌中b220
+
iga
+
的数量显著高于pbs和nc8组，表明在重组植物乳酸菌的刺激下抗体分泌量显著增加，成功活化了b淋巴细胞的反应；
74.两种重组植物乳酸菌在口服灌胃后均能够刺激派尔集合淋巴结中cd80
+
和cd86
+
表面标志的活化，表明两种重组植物乳酸菌均能够使树突状细胞活化，使其进一步发挥其抗原摄取呈递功能；
75.通过灌胃的方式免疫小鼠，两株重组植物乳酸菌能更好的刺激dc细胞的活化，诱导小鼠产生细胞因子，促进t细胞增殖，提高b细胞的活化水平，为生发中心的形成提供了条件，并促进了iga的表达。
76.另一方面，本发明成功构建了nc8-plp-s-p14.5，nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus和nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d三种重组植物乳杆菌，并验证了它们在体外的成功表达；由于乳酸菌可以在小鼠肠道内定殖，并能在肠道环境下可以刺激乳酸菌表达p54蛋白以及p54-il-33、cta1-p14.5-d-d融合蛋白，机体t细胞识别p54蛋白以及p54-il-21融合蛋白并产生特异性的抗体；用小鼠进行初步动物试验，结果可见饲喂重组植物乳杆菌对于小鼠的免疫效果具有一定的提升作用；
77.由流式细胞术实验可见饲喂重组植物乳杆菌组小鼠的pp结淋巴细胞中b220和iga的分泌的量以及11c
+
cd80和11c
+
cd86的含量大于对照组；脾脏中cd4
+
ifn-γ
+
cd4
+
il-4和的cd8
+
ifn-γ
+
cd8
+
il-4表达量也有显著的增强。
78.本发明的实验结果都表明了当饲喂本发明的重组植物乳杆菌后，小鼠的免疫力有显著的提高。
附图说明
79.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
80.图1为：实施例1中的双酶切获得载体；1：双酶切；
81.图2为：实施例1中的puc-gw-kan-pfpp双酶切和puc-gw-kan-pmfpp双酶切；1：puc-gw-kan-pfpp双酶切；2：puc-gw-kan-pmfpp双酶切；
82.图3为：实施例1中的重组质粒psip409-pgsa
’‑
pfpp和psip409-pgsa
’‑
pmfpp的双酶切验证；1：重组质粒psip409-pgsa
’‑
pfpp双酶切；2：重组质粒psip409-pgsa
’‑
pmfpp双酶切；
83.图4为：实施例1中的psip409-pgsa
′‑
pfpp/pmfpp质粒图谱；
84.图5为：实施例1中的nc8-psip409-pgsa
′‑
pfpp菌落形态；
85.图6为：实施例1中的nc8(psip409-pgsa’)，nc8(psip409-pfpp)，nc8(psip409-pmfpp)的菌株生长曲线图；
86.图7为：实施例1中的westen blot结果；
87.图8为：实施例2中的动物免疫程序；
88.图9为：实施例2中脾脏中cd4+il-4+和的cd8+ifn-γ+表达；
89.图10为：实施例2中派尔集合淋巴结中b220+iga+的表达；
90.图11为：实施例2中派尔集合淋巴结中树突状细胞的活化。
91.图12为：实施例3中的plp-s-p14.5质粒双酶切验证(m:dl15000 marker；1-4：第1-4号克隆酶切结果)；
92.图13为：实施例3中的plp-s-cta1-p14.5-d-d质粒双酶切验证(m:dl15000 marker；1-2：第1-2号克隆酶切结果)；
93.图14为：实施例3中的plp-s-p14.5-il-33-mus质粒双酶切验证(m:dl10000 marker；1：第1号克隆酶切结果)；
94.图15为：实施例3中的成功构建好的nc8-plp-s-p14.5质粒图谱；
95.图16为：实施例3中的成功构建好的nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus质粒图谱；
96.图17为：实施例3中的成功构建好的nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d质粒图谱；
97.图18为：实施例3中的p14.5 pcr产物电泳图(m：dl2000 marker；1：p14.5 pcr产物)；
98.图19为：实施例3中的bl21-pet-28a-p14.5质粒双酶切验证(m:dl10000 marker；1：第1号克隆酶切结果)；
99.图20为实施例3中的nc8-plp-s、nc8-plp-s-p14.5、nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus、nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d菌株生长曲线图；
100.图21为：实施例4中pbs组、nc8-plp-s组、nc8-plp-s-p14.5组、nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d组、nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus组脾脏淋巴细胞中分泌量图及柱状图；其中，(a)为pbs组的ifn-γ分泌量；(b)为nc8-plp-s组的ifn-γ分泌量，(c)为nc8-plp-s-p14.5
组的ifn-γ分泌量，(d)为nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d组的ifn-γ分泌量，(e)为nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus组的ifn-γ分泌量；
101.图22为：实施例4中pbs组、nc8-plp-s组、nc8-plp-s-p14.5组、nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d组、nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus组的脾脏淋巴细胞中cd3
+
cd4
+
t细胞中il-4分泌量图及柱状图，其中，(a)为pbs组的il-4分泌量；(b)为nc8-plp-s组的il-4分泌量，(c)为nc8-plp-s-p14.5组的il-4分泌量，(d)为nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d组的il-4分泌量，(e)为nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus组的il-4分泌量；
102.图23为：实施例4中脾脏淋巴细胞中cd3
+
cd8
+
t细胞中il-4分泌量；
103.图24为：实施例4中脾脏淋巴细胞中cd3
+
cd8
+
t细胞中ifn-γ分泌；
104.图25为：实施例4中脾派依氏集合淋巴结(pp)细胞中11c
+
80
+
含量；
105.图26为：实施例4中脾派依氏集合淋巴结(pp)细胞中11c
+
86
+
含量；
106.图27为：实施例4中脾派依氏集合淋巴结(pp)细胞中b220
+
iga
+
含量。
具体实施方式
107.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本技术使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
108.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
109.下面结合具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明。
110.实施例1
111.表达非洲猪瘟病毒融合抗原的重组植物乳酸菌的构建及验证
112.1.1材料与方法
113.本试验中使用的菌株和质粒见表1。
114.表1菌株与质粒
[0115][0116]
1.1.1.2酶与主要试验试剂
[0117]
限制性内切酶xba i与hindⅲ、primestar max premix(2
×
)、dna marker
(dl5000、dl10000、dl15000)、10xloading buffer、核酸电泳凝胶琼脂糖均购自于宝生物工程(大连)有限公司(takara)；快速dna连接试剂盒(rapid dna ligation kit)、dna末端平滑试剂盒(dna blunting kit)、bca蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(enhanced bca protein assay kit)购自碧云天生物有限公司；sppip由吉林省动物微生态制剂工程研究中心保存；牛肉粉、购自英国oxoid公司；dap、d-丙氨酸购自sigma公司；dna凝胶回收纯化试剂盒gel extraction kit购自omega公司、高纯度质粒小提试剂盒fast pure plasmid mini kit、180kda prestained protein marker购自vazyme公司、sds-page上样缓冲液购自北京康为世纪巴西vs瑞士让球有限公司；硫酸卡那霉素粉末、红霉素粉末、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)粉末购自北京索莱宝科技有限公司；super gelblue荧光核酸凝胶染色试剂(美国everbright公司)；无缝克隆试剂盒seamless assembly cloning kit(中美泰和生物技术有限公司)；pbs磷酸盐缓冲液购自solarbio公司；试验所需其他试剂为国产分析纯产品或进口。
[0118]
1.1.1.4.1培养基的配置
[0119]
(1)lb液体培养基：氯化钠10.0g/l，胰蛋白胨10.0g/l，酵母提取物5.0g/l，超纯水中溶解，121℃高压灭菌20min。
[0120]
(2)lb固体培养基：氯化钠10.0g/l，胰蛋白胨10.0g/l，酵母提取物5.0g/l，细菌学琼脂粉15g/l；超纯水中溶解，121℃高压灭菌20min。
[0121]
(3)mrs液体培养基：牛肉提取物10.0g/l，胰蛋白胨10.0g/l，d-无水葡萄糖20.0g/l，三水合醋酸钠5.0g/l，酵母提取物0.05g/l，吐温-80 1.0g/l，磷酸氢钾2.0g/l，柠檬酸三铵2.0g/l，磷酸氢二钾三水合物2.0g/l，七水硫酸镁0.2g/l，一水硫酸锰0.05g/l；超纯水中溶解，115℃高压灭菌15min。
[0122]
(4)mrs固体培养基：牛肉提取物10.0g/l，胰蛋白胨10.0g/l，d-无水葡萄糖20.0g/l，三水合醋酸钠5.0g/l，酵母提取物0.05g/l，吐温-80 1.0g/l，磷酸氢钾2.0g/l，柠檬酸三铵2.0g/l，磷酸氢二钾三水合物2.0g/l，七水硫酸镁0.2g/l，一水硫酸锰0.05g/l，细菌学琼脂粉15g/l；超纯水中溶解，115℃高压灭菌15min。
[0123]
1.1.1.4.2核酸电泳溶液配置
[0124]
(1)50
×
tae电泳缓冲液贮液：冰乙酸57.1ml，tris 242g，0.5mol/l edta(8.0)100ml，超纯水1l；
[0125]
(2)1％琼脂糖凝胶：1
×
tae 100ml，琼脂糖1g；
[0126]
加热溶解后，冷却至65℃左右加入10μl super gelblue后混匀，冷却30min。
[0127]
1.1.1.4.3热激转化溶液：
[0128]
0.1mol/l cacl2溶液，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；0.1mol/l cacl2(含15％甘油)，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min。
[0129]
1.1.1.4.4电击转化溶液配置
[0130]
(1)电击缓冲液配置：蔗糖34.21g，mgcl
2 0.029g，超纯水100ml，将ph值调至7.4后，121℃高压蒸汽灭菌20min，-20℃保存。
[0131]
(2)清洗缓冲液配置：na3po
4 0.19g，mgcl
2 0.009g，超纯水100ml，将ph值调至7.4后，121℃高压蒸汽灭菌20min，-20℃保存。
[0132]
(3)0.5mol/l蔗糖配置：蔗糖17.1g，超纯水100ml，121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃
保存。
[0133]
(4)2％甘氨酸配置：甘氨酸2g，超纯水100ml，在无菌环境操作，溶解后使用0.22um除菌过滤器除菌。
[0134]
1.1.1.4.5western bloting电泳溶液配置
[0135]
(1)5
×
sds-page电泳缓冲液的配制：tris碱15.1g，超纯水600ml，甘氨酸94.0g，10％sds 50ml，超纯水350ml；
[0136]
(2)10
×
转膜液配方：tris 15.1g，甘氨酸72.0g，sds 1.85g，超纯水400ml，搅拌至完全溶解后定容至500ml。
[0137]
(3)10
×
tbs溶液：nacl 236g，tris 72.6g，超纯水2l；搅拌至完全溶解后定容至3l，浓盐酸调ph7.6。
[0138]
(4)tbst溶液：10
×
tbs 100ml，tween 20 1ml，超纯水1l；搅拌至完全溶解，4℃保存。
[0139]
(5)封闭缓冲液：脱脂奶粉5g，tbst 100ml，搅拌至完全溶解，4℃保存。
[0140]
1.1.1.4.6抗生素的配置
[0141]
(1)10mg/ml卡那霉素的配制：甘油1g，超纯水100ml，在无菌环境操作，溶解后使用0.22um除菌过滤器除菌，在1.5ml无菌ep管中-20℃储存。
[0142]
(2)20mg/ml红霉素的配制：甘油2g，无水乙醇100ml，在无菌环境操作，溶解后使用0.22um除菌过滤器除菌，在1.5ml无菌ep管中-20℃储存。
[0143]
1.1.1.4.7其余溶液的配置
[0144]
(1)80％甘油的配制：甘油80ml，超纯水20ml，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min。
[0145]
(2)pbs磷酸盐缓冲液的配制：pbs磷酸盐缓冲液粉末1袋，超纯水2l，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min。
[0146]
(3)200mg/ml iptg的配制：iptg 2g，超纯水8ml，完全溶解后用超纯水定容至10ml，用0.22um除菌过滤器除菌，1ml/管分装至1.5ep管中，-20℃保存。
[0147]
1.1.2试验方法
[0148]
1.1.2.1重组植物乳酸菌的构建与鉴定
[0149]
1.1.2.1.1目的基因的合成
[0150]
目的基因：p54-fc-p30-egp核苷酸序(seq id no.1)
[0151]
1.1.2.1.2引物设计
[0152]
为了鉴定重组质粒的正确性，设计了针对psip409-pgsa
’‑
erm载体的通用引物，能够鉴定pgsa’序列后xbaⅰ和hindⅲ之间的基因片段，用于pcr鉴定及测序。引物序列如下：
[0153]
f 5
’‑
agatattgttggtgctgg-3’[0154]
r 5
’‑
tcaatcaaagcaacacg-3’[0155]
1.1.2.1.3载体和目的片段的获取
[0156]
1.1.2.1.3.1e.coli dh5α感受态的制作
[0157]
a.将0.1mol/l cacl2溶液、含15％甘油的0.1mol/l cacl2溶液放置于4℃冰箱预冷，1.5ml离心管在-80℃冰箱预冷；
[0158]
b.活化复苏大肠杆菌dh5α，200rpm 37℃摇床有氧培养12h；
[0159]
c.使用接菌环在lb固体培养基上划线接种培养16h；
[0160]
d.挑取dh5α单菌落接种于5ml液体lb培养基中37℃200rpm培养12h；
[0161]
e.取1ml菌液接种100ml液体lb培养基中，37℃180rpm培养至od
600
达到0.4-0.5；
[0162]
f.将菌液转移至50ml灭菌离心管中，冰浴15min；
[0163]
g.4℃4000rpm离心10min，弃上清；用15ml 0.1mol/l cacl2溶液轻轻浮混匀菌体，冰浴10min；
[0164]
h.4℃4000rpm离心10min，弃上清；用15ml 0.1mol/l cacl2溶液轻轻悬浮混匀菌体，冰浴30min；
[0165]
i.4℃4000rpm离心10min，弃上清；用2ml含15％甘油的0.1mol/l cacl2溶液悬浮混匀菌体，冰浴30min；
[0166]
j.100μl/管，分装入-80℃预冷的灭菌1.5ml离心管中，液氮速冻后-80℃保存
[0167]
1.1.2.1.3.2将含有目的片段的puc-gw-kan载体的质粒转入e.coli dh5α扩增并保存
[0168]
a.将公司(genewiz)合成的puc-gw-kan-pfpp和puc-gw-kan-pmfpp质粒冻干粉(2μg)12000rpm离心2min后加10μl超纯水稀释；
[0169]
b.从-80℃冰箱取出dh5α感受态放置于冰上，待感受态菌处于冰水混合物状态时，加入1μl质粒，轻轻混匀，冰浴20min；
[0170]
c.在42℃水浴锅中热激1min 30s后立即放回冰上冰浴5min；
[0171]
d.加入600μl 37℃预热的lb液体培养基，混匀后在37℃摇床上200rpm振荡培养复苏1h；
[0172]
e.4000rpm离心5min，弃600μl液体，混匀菌体沉淀，在加入10μg/ml卡那霉素的lb固体培养基上涂板；
[0173]
f.37℃温箱正置吸收1h后，倒置培养12h以上；
[0174]
g.挑取单菌落在加入10μg/ml卡那霉素的5ml lb液体培养基中培养12h；
[0175]
h.吸取800μl菌液加200μl 80％甘油在-80℃冰箱中保存；
[0176]
i.剩余菌液提取质粒(详细方法见vazyme fastpure plasmid mini kit使用说明书)，-20℃冰箱保存。
[0177]
1.1.2.1.4目的片段和载体连接
[0178]
在加入200μg/ml红霉素的lb液体培养基培养实验室保存的含有psip409-pgsa’质粒的克隆菌12h。
[0179]
提取质粒(详细方法见vazyme fastpure plasmid mini kit使用说明书)。
[0180]
使用hind iii和xho i对psip409-pgsa’、puc-gw-kan-pfpp、puc-gw-kan-pmfpp三种质粒进行双酶切。酶切体系如下：plasmid 20μl，xbaⅰ0.5μl，hindⅲ0.5μl，10xbufferm 3μl，bsa 3μl，ultrapure water 3μl，总共30μl；
[0181]
37℃酶切6h后加入3μl 10xloading buffer，在1％琼脂糖凝胶100v核酸电泳35min。进行胶回收获得线性dna(胶回收方法详见omegagel extraction kit使用说明书)。
[0182]
pfpp、pmfpp回收产物分别通过rapid t4 dna ligase连接酶与psip409-pgs’线性化载体连接。按照载体：片段物质的量比1：3进行连接，根据rapid t4 dna ligase连接能力
设载体量为75ng，dsdna平均分子量以650(dal/bp)计算。根据载体6160bp，片段2085bp，得出片段质量约为76ng。
[0183]
psip409-pgsa
’‑
pfpp连接反应体系如下：2
×
t4 dna ligase buffer 10μl，vector(psip409-pgsa’)0.65μl，insert(pfpp)0.3μl，rapid t4 dna ligase 1μl，ultrapure water 8.05μl，总共20μl；
[0184]
psip409-pgsa
’‑
pmfpp连接反应体系如下：2
×
t4 dna ligase buffer 10μl，vector(psip409-pgsa’)0.65μl，insert(pmfpp)0.2μl，rapid t4 dna ligase 1μl，ultrapure water 8.15μl，总共20μl；25℃孵育30min，-20℃保存。
[0185]
1.1.2.1.5psip409-pgsa’空载体构建
[0186]
在1.1.2.1.4中双酶切得到psip409-pgsa’线性dna载体，通过dna末端平滑试剂盒使xba i与hindⅲ限制性内切酶切开的粘末端转变为平末端。
[0187]
反应体系如下：
[0188]
psip409-pgsa’粘性末端平滑化反应体系：t4 dna polymerase 1μl，reaction buffer(5x)，4μl，dntp mixture 0.8μl，psip409-pgsa’(linear dna)7μl，ultrapure water 7.2μl，总共20μl；25℃孵育10min，70℃孵育15min终止反应。
[0189]
使用快速dna连接试剂盒使线性dna自身环化。反应体系如下：psip409-pgsa’平末端环化反应体系：2
×
t4dna ligase buffe 5μl，rapid t4 dna ligase 1μl，psip409-pgsa’(linear dna)2μl，ultrapure water 2μl，总共10μl；25℃孵育30min，-20℃保存。
[0190]
1.1.2.1.6热激法将连接产物转化到e.coli dh5a感受态并保存
[0191]
a.从-80℃冰箱取出dh5α感受态放置于冰上，待感受态菌处于冰水混合物状态时，加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴20min；
[0192]
b.在42℃水浴锅中热激1min 30s后立即放回冰上冰浴5min；
[0193]
c.加入600μl 37℃预热的lb液体培养基，混匀后在37℃摇床上200rpm振荡培养复苏1h；
[0194]
e.4000rpm离心5min，弃600μl液体，混匀菌体沉淀，在加入200μg/ml红霉素的lb固体培养基上涂板；
[0195]
f.37℃温箱正置吸收1h后，倒置培养12h以上；
[0196]
g.挑取单菌落在加入200μg/ml红霉素的5ml lb液体培养基中培养12h；
[0197]
h.吸取800μl菌液加200μl 80％甘油在-80℃冰箱中保存；
[0198]
i.剩余菌液提取质粒(详细方法见vazyme fastpure plasmid mini kit使用说明书)，-20℃冰箱保存。
[0199]
1.1.2.1.7 e.coli dh5a中重组质粒的鉴定
[0200]
1.1.2.1.7.1酶切鉴定
[0201]
psip409-pgsa
’‑
pfpp和psip409-pgsa
’‑
pmfpp酶切鉴定体系如下：
[0202]
酶切体系：plasmid 1μl，xbaⅰ0.2μl，hindⅲ0.2μl，10xbufferm 1μl，bsa 1μl，ultrapure water 6.6μl，总共10μl；
[0203]
psip409-pgsa’自连质粒酶切鉴定体系如下：plasmid 2μl，bamhi 1μl，10xbufferk 1μl，ultrapure water 6μl，总共10μl；
[0204]
37℃金属浴4h后，加入1μl 10xloading buffer，在1％琼脂糖凝胶120v核酸电泳
25min鉴定条带大小是否正确。
[0205]
1.1.2.1.7.2 pcr鉴定
[0206]
将质粒稀释至10ng/μl后进行pcr，pcr鉴定体系如下：forward primer 1.25μl，reverse primer 1.25μl，plasmid2μl，primemax dna polymerase 25μl，ultrapure water 20.5μl，总共50μl；
[0207]
pcr扩增条件如下：
[0208][0209]
pcr产物加入5μl 10xloading buffer，在1％琼脂糖凝胶120v核酸电泳25min，鉴定条带大小是否正确。
[0210]
1.1.2.1.7.3质粒测序
[0211]
酶切及pcr鉴定正确后送至吉林省库美巴西vs瑞士让球有限公司对质粒进行测序。
[0212]
1.1.2.1.8重组质粒转化到nc8
[0213]
1.1.2.1.8.1 nc8感受态制作
[0214]
a.电击缓冲液、清洗缓冲液在4℃冰箱预冷，1.5m lep管在-80℃冰箱预冷；
[0215]
b.取nc8冻存菌于5ml mrs液体培养基中，37℃厌氧活化复苏培养12h；
[0216]
c.使用接菌环蘸取菌液在mrs固体培养基上划线，37℃厌氧培养16-18h；
[0217]
d.挑取nc8单菌落接种于5ml mrs液体培养基中，加入100μl 2％gly 37℃厌氧培养7-8h；
[0218]
e.取2ml菌液接种于100ml mrs液体培养基中，加入2ml 2％gly 37℃厌氧传代培养至od
600
达到0.2-0.3；
[0219]
f.菌液转移至两个50ml离心管中，冰浴10min，4℃5000rpm离心10min，弃去上清；
[0220]
g.两管分别用10ml预冷的清洗缓冲液重悬沉淀，4℃5000rpm离心10min弃去上清；
[0221]
h.重复一遍，再用预冷的清洗缓冲液重悬沉淀，4℃5000rpm离心10min弃去上清；
[0222]
i.两管分别用1ml电击缓冲液悬浮菌体，冰浴10min，100μl/管分装至1.5ml ep管中，液氮速冻后在-80℃冰箱保存。
[0223]
1.1.2.1.8.2重组质粒的转化及保存
[0224]
a.将2mm电击杯在75％酒精中浸泡过夜；
[0225]
b.在紫外灯下完全晾干，在冰上预冷；
[0226]
c.从-80℃冰箱取出nc8感受态放置于冰上，待感受态菌处于冰水混合物状态时，加入1μl质粒，轻轻混匀，转移至电击杯中，冰浴10min；
[0227]
d.设置电穿孔系统条件为，输出电压2000v、电容量25μf、样品电阻400ω、电击杯电极间距2mm；电击结束后室温静置3min；
[0228]
e.加入600μl 30℃预热的mrs液体培养基、150μl 0.5mol/l蔗糖，混匀后转移至1.5ml离心管中，30℃水浴培养复苏3h；
[0229]
f.4000rpm离心5min，弃600μl液体，混匀菌体沉淀后，在加入10μg/ml红霉素的mrs固体培养基上涂板，37℃厌氧培养，正置吸收1h后，倒置培养17h；
[0230]
g.挑取单菌落在加入10μg/ml红霉素的5ml mrs液体培养基中37℃厌氧培养12h；
[0231]
h.吸取800μl菌液加200μl 80％甘油在-80℃冰箱中保存；
[0232]
i.剩余菌液提取质粒，在悬浮菌体沉淀后加入180μl 50μg/μl溶菌酶，37℃水浴1h，其余步骤按照vazyme fastpure plasmid mini kit使用说明书操作，质粒在-20℃冰箱保存
[0233]
1.1.2.1.9nc8中重组质粒验证
[0234]
将提取的重组植物乳酸菌质粒，进行pcr以及酶切鉴定。利用pcr技术对nc8中重组质粒的目的片段进行扩增，以此鉴定重组质粒是否成功转化到nc8中。鉴定体系及扩增程序同1.1.2.1.7.。
[0235]
1.1.2.2 p30、p54多克隆抗体的制备
[0236]
1.1.2.2.1 p30、p54原核表达载体的构建
[0237]
1.1.2.2.1.1引物设计
[0238]
为得到带有pet28a同源臂的p54及p30单抗原线性dna p30a和p54a，设计上下游引物进行pcr扩增，引物序列如下：
[0239]
p54a f：
[0240]
5-aagaaggagatataccatggatggatagtgaattttttcaaccg-3
[0241]
p54a r：
[0242]
5-tggtggtggtggtgctcgagcagactattttccagatctttatgcg-3
[0243]
p30a f：
[0244]
5-aagaaggagatataccatggatggattttattctgaatattagtatgaa-3
[0245]
p30a r：
[0246]
5-tggtggtggtggtgctcgagaatatacgtcagaaaaaagttaattttc-3
[0247]
1.1.2.2.1.2获得p30a和p54a线性dna
[0248]
将puc-gw-kan-pfpp质粒稀释分别至10ng/μl后进行pcr，pcr扩增体系体系如下：forward primer 1.25μl，reverse primer 1.25μl，plasmid 2μl，primemax dna polymerase 25μl，ultrapure water 20.5μl，总共50μl；
[0249]
pcr扩增条件如下：
[0250][0251]
pcr产物加入5μl 10xloading buffer，在1％琼脂糖凝胶100v核酸电泳35min，进行胶回收获得p30a和p54a线性dna(胶回收方法详见omegagel extraction kit使用说明书)。
[0252]
1.1.2.2.1.3构建pet28a-p30a和pet28a-p54a原核表达质粒
[0253]
使用xho i和nco i对pet28a载体进行线性化，酶切体系如下：plasmid 10μl，xhoⅰ1.5μl，nco i 1.5μl，10xbufferk 2μl，ultrapure water 5μl，总共20μl；
[0254]
37℃酶切6h后加入2μl 10xloading buffer，在1％琼脂糖凝胶100v核酸电泳35min。进行胶回收获得线性dna(胶回收方法详见omegagel extraction kit使用
说明书)。
[0255]
按照载体：片段物质的量比1：3进行连接，根据seamless master mix连接能力设载体量为60ng，dsdna平均分子量以650(dal/bp)计算。根据载体pet28a 5369bp，片段p30a为643bp、p54a为592bp，得出片段p30a质量约为18ng、片段p54a质量约为16.6ng。使用无缝克隆试剂盒进行连接，pet28a-p30a连接体系如下：vector(pet28a)3.75μl，insert(p30a)1μl，2xseamless master mix 5μl，ultrapure water 0.25μl，总共10μl；
[0256]
pet28a-p54a连接体系如下：vector(pet28a)3.75μl，insert(p30a)0.7μl，2xseamless master mix 5μl，ultrapure water 0.55μl，总共10μl；50℃连接20min。
[0257]
1.1.2.2.1.4将pet28a-p30a和pet28a-p54a原核表达质粒转入dh5α扩增并保存
[0258]
步骤同1.1.2.1.3.2
[0259]
1.1.2.2.1.5e.coli dh5a中pet28a-p30a和pet28a-p54a重组质粒的鉴定
[0260]
酶切鉴定体系如下：plasmid 1μl，xhoⅰ0.5μl，nco i 0.5μl，10xbufferk 1μl，ultrapure water 7μl，总共10μl；
[0261]
37℃金属浴4h后，加入1μl 10xloading buffer，在1％琼脂糖凝胶120v核酸电泳25min鉴定条带大小是否正确。
[0262]
1.1.2.2.1.6将pet28a-p30a和pet28a-p54a原核表达质粒转入bl21感受态
[0263]
步骤同1.1.2.1.3.2
[0264]
1.1.2.2.2.切胶纯化蛋白
[0265]
a.接菌bl21-pet28a-p30a和bl21-pet28a-p54a至含有10μg/ml卡那霉素的液体lb培养基中37℃200rpm培养8h；
[0266]
b.转接10ml菌液至含有10μg/ml卡那霉素的1l液体lb培养基中37℃200rpm培养至od
600
达到0.6-0.8；
[0267]
c.加入250μl 200mg/ml iptg，37℃200rpm诱导4h；
[0268]
d.分几次将菌液转移至若干50ml离心管中，4℃1000rpm离心10min，用pbs悬浮混匀菌体沉淀，收集在一起；
[0269]
e.使用液氮反复冻融3次；
[0270]
f.200w超声破碎，超声程序为每10s中超声5s，停5s，持续10min；
[0271]
g.4℃10000rpm离心20min弃上清；
[0272]
h.用含有2m尿素的pbs悬浮混匀沉淀，4℃10000rpm离心5min弃上清；
[0273]
i.用含有4m尿素的pbs悬浮混匀沉淀，4℃10000rpm离心5min弃上清；
[0274]
j.用含有8m尿素的pbs悬浮混匀沉淀，4℃摇床上浸泡7h；
[0275]
k.用0.22um除菌过滤器过滤，4℃10000rpm离心20min，取800μl加入200μl 5xsds page buffer，离心管夹上防爆夹，在沸水中煮样10min；
[0276]
l.样品80v进行蛋白电泳，电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端停止；
[0277]
m.使用0.25m kcl处理确定蛋白条带位置，切胶并捣碎，用pbs浸泡8h；
[0278]
n.4℃10000rpm离心20min，吸取上清液，准备96孔板，使用bca蛋白浓度测定试剂盒(增强型)测定蛋白浓度，使用pbs补足体积，其他具体操作步骤见产品说明书；
[0279]
o.37℃孵育30min后，使用epoch 2微孔板分光光度计进行吸光度测定，用elisacalc回归/拟合程序根据标准曲线计算蛋白浓度。
[0280]
1.1.2.2.3兔源抗体的制备
[0281]
a.购买6周龄白兔一只，观察3天以适应环境变化。
[0282]
b.将纯化的抗原与佐剂结合，第一次免疫剂量为200μg抗原，即1ml纯化的抗原加1ml完全弗氏佐剂。间隔10天进行第二次免疫，免疫剂量为1ml纯化的抗原加1ml不完全弗氏佐剂。间隔10天后进行第三次免疫，免疫剂量为1ml纯化的抗原加1ml不完全弗氏佐剂。
[0283]
c.第三次免疫后十天，将兔进行呼吸麻醉，心脏取血，离心获得血清。
[0284]
1.1.2.3重组植物乳酸菌蛋白表达鉴定
[0285]
1.1.2.3.1植物乳酸菌蛋白样的处理
[0286]
植物乳酸菌蛋白样的处理有两种方法，如下：
[0287]
(一)超声破碎法
[0288]
a.将-80℃冰箱中保存的重组植物乳酸菌进行活化，接到5ml mrs液体培养基中37℃厌氧工作站培养过夜；
[0289]
b.第二天1：40转接到40ml离心管中，30℃厌氧培养3h(od
600
在0.3左右)，加sppip诱导肽(每5ml mrs液体培养基中加入12.5μl),诱导培养至对数生长期；
[0290]
c.5000rpm，离心10min，留200μl，加pbs混悬；
[0291]
d.超声破碎10min，再次离心，去上清；
[0292]
e.向沉淀中加入1ml pbs混悬，12000rpm，离心1min，抽出上清备用；
[0293]
f.向沉淀中加入300μl ddh2o，再加入100μl5
×
sds page buffer混匀；
[0294]
g.离心管夹上防爆夹于100℃沸水浴煮沸10min，然后12000rpm，离心1min，用上清上样，样品可保存于-20℃。
[0295]
(二)反复冻融法
[0296]
a.将-80℃冰箱中保存的重组植物乳酸菌进行活化，接到5ml mrs液体培养基中37℃厌氧工作站培养过夜；
[0297]
b.第二天1：40转接到40ml离心管中，30℃厌氧培养3h(od
600
在0.3左右)，加sppip诱导态(每5ml mrs液体培养基中加入12.5μl)，诱导培养至对数生长期；
[0298]
c.取2ml菌液，5000rpm离心5min，去上清；
[0299]
d.向沉淀中加入1ml tes溶液悬起，37℃水浴30min；
[0300]
e.水浴后离心，2500g离心10min，沉淀用1ml pbs悬起；
[0301]
f.然后2500g离心5min，用500μl ddh2o重悬，放入-80℃冰箱中反复冻融5次；
[0302]
g.4℃18000g离心2个40min以上；
[0303]
h.向沉淀中加入150μl pbs和50μl 5
×
sds page buffer混匀；
[0304]
i.离心管夹上防爆夹于100℃沸水浴煮沸10min，然后12000rpm，离心1min，用上清上样，样品可保存于-20℃。
[0305]
1.1.2.3.2 western blot技术
[0306]
通过western blot技术，血清作为一抗，山羊抗兔hrp为二抗，孵育dcpep阳性植物乳酸菌样品验证抗体是否制备成功。方法如下：a.先装好制胶玻璃板，用ddh2o验漏，验漏20min，以水面不下降为宜；b.配置分离胶(下层胶)，混匀后，加入到玻璃板之间，以水封顶，使液面水平，静置20min，使胶凝固；c.配置浓缩胶(上层胶)，倒去玻璃板间的水，用滤纸吸干，轻轻加浓缩胶，插入梳子，避免出现气泡，静置20min，使胶凝固；d.待上层胶完全聚合
后，小心拔出梳子，然后将玻璃板固定在电泳槽中，添加1
×
sds溶液至淹没胶板；e.加样：在胶孔中加入10μl处理好的样品及marker；f.电泳：连接电源，上层胶电压80v，下层胶电压120v，电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端停止；g.轻轻撬开制胶玻璃板，取出胶板，移除浓缩胶，用切割刀修好胶，置于转膜液中浸泡；h.转膜：按顺序放好下列物质：黑面
→
海绵
→
滤纸
→
胶
→
nc膜
→
滤纸
→
海绵，赶出气泡，置于转膜槽中，黑面对黑面，加入转膜液，在冰上进行转膜；i.装好电极，于恒电流200ma转1.5h；j.封闭：加入5％脱脂奶粉以及100ml tbst常温摇床封闭1h；k.孵育一抗：回收封闭液，加入一抗(用5％bsa以及tbst稀释)，置于4℃摇床过夜；l.回收一抗，加入tbst在摇床上洗膜3次，每次10min；m.孵育二抗：加入二抗(二抗用5％脱脂奶粉加tbst稀释)，常温摇床1h；n.回收一抗，加入tbst在摇床上洗膜3次，每次10min；o.将膜置于成像系统中，滴入发光液，进行曝光。
[0307]
1.1.2.4植物乳酸菌培养条件优化
[0308]
1.1.2.4.1重组植物乳酸菌菌生长曲线测定
[0309]
a.将nc8-psip409-pgsa
′
，nc8-psip409-pgsa
′‑
pfpp和nc8-psip409-pgsa
′‑
pmfpp分别划线于加入200μg/ml红霉素的平板上，于37℃厌氧培养16h；选取中等大小的单菌落接种于5ml含200μg/ml红霉素的mrs液体培养基中活化培养12h；
[0310]
b.取活化的nc8菌液1ml接菌于50ml加入200μg/ml红霉素的mrs培养基中；2h后加入植物乳酸菌诱导剂sppip 125μl；
[0311]
c.每间隔1h从各组菌液中分别取2ml测od值，进行12小时的监测并绘制生长曲线。
[0312]
1.1.2.4.2菌落滴板计数
[0313]
将1.1.2.4.1中第7h和第8h的菌液梯度稀释，分别梯度稀释到106，107，108后取100μl进行在含有200μg/ml红霉素的固体培养基上进行滴板计数。
[0314]
1.2结果
[0315]
1.2.1重组植物乳酸菌的构建与鉴定
[0316]
1.2.1.1目的基因的合成
[0317]
pfpp和pmfpp基因为2085bp
[0318]
1.2.1.2载体和目的片段的获取
[0319]
载体和目的片段分别进行双酶切，在6160bp(图1)处可见载体条带，2085bp(图2)处可见目的片段条带。
[0320]
1.2.1.3e.coli dh5α中重组质粒的鉴定
[0321]
1.2.1.3.1酶切鉴定
[0322]
将重组质粒psip409-pgsa
’‑
pfpp和psip409-pgsa
’‑
pmfpp双酶切验证，在2085bp处可见清晰条带(图3)。
[0323]
1.2.1.3.2质粒测序
[0324]
质粒测序由长春库美公司测定，测序结果证明100％正确，无任何突变。质粒图谱如下(图4)。
[0325]
1.2.1.4 nc8中重组质粒的鉴定
[0326]
采用上述构建方法获得的重组乳杆菌命名为cfwdd-0369，所述重组植物乳杆菌cfwdd-0369的特性如下：凸起、中等大小、微白色边缘整齐，符合植物乳杆菌的形态(图5)。
[0327]
1.2.1.4.1酶切鉴定
[0328]
该重组植物乳杆菌nc8-psip409-pgsa
′‑
pfpp双酶切鉴定，获得长度6161bp大小的载体与2085bp的目的条带，包含保护性融合抗原p54-fc-p30-egp基因片段。
[0329]
1.2.1.4.2 pcr鉴定
[0330]
1.2.2p30和p54多克隆抗体的鉴定
[0331]
1.2.3植物乳酸菌培养条件优化
[0332]
1.2.3.1生长曲线测定
[0333]
对该重组植物乳酸菌nc8-psip409-pgsa
′‑
pfpp进行菌落生长曲线及菌落计数测定，添加诱导剂浓度为500ng/ml，于30℃厌氧工作站在mrs培养基中培养2h时添加诱导剂，最佳诱导时长为7-8h。生长曲线测定结果(12h)用graphpad prism软件绘制，见图6。
[0334]
1.2.3.2菌落滴板计数结果
[0335]
1.2.4重组植物乳酸菌的表达鉴定
[0336]
1.2.4.2流式细胞术鉴定融合蛋白表达
[0337]
经western-blot试验检测，上述诱导条件可成功诱导重组植物乳酸菌nc8-psip409-pgsa
′‑
pfpp表面包含p54-fc-p30-egp抗原，成功表达大小约为98kda的表面锚定融合蛋白pgsa
’‑
p54-fc-p30-egp，westen blot结果如图7所示。
[0338]
1.2.4.2流式细胞术鉴定融合蛋白表达
[0339]
1.2.4.3免疫荧光鉴定融合蛋白表达
[0340]
fitc标记的二抗可与兔源一抗相结合，从而可见植物乳杆菌表面锚定表达的融合蛋白有绿色荧光。
[0341]
实施例1试验成功构建了nc8-psip409-pgsa
’‑
pfpp和nc8-psip409-pgsa
’‑
pmfpp重组植物乳酸菌。此外，成功制备了兔源p30和p54多克隆抗体血清。验证了2组非抗生素重组植物乳酸菌所表达的融合蛋白免疫原性，且重组植物乳酸菌将非洲猪瘟病毒egp多肽和p30蛋白融合与p54-fc融合蛋白通过螺旋结构蛋白连接子连接并锚定表达在植物乳杆菌表面。
[0342]
实施例2
[0343]
实施例1构建的重组植物乳酸菌的免疫效果：
[0344]
植物乳酸菌疫苗有着成本低廉，便于规模化生产的优势，且能够在机体肠道内长期定植，持续发挥作用，并且植物乳酸菌自身就是益生菌，能够提高机体免疫力、促进黏膜免疫。口服的免疫方式，又使之更为方便。因此，重组植物乳酸菌疫苗有着广阔的发展前景。本试验构建的重组植物乳酸菌为非抗生素植物乳酸菌，对环境而言更为友好，对动物而言避免了抗生素耐受。
[0345]
实施例2试验设定初次免疫与加强免疫程序，诱导2组重组植物乳酸菌表达，并设置对照组，分别对各组小鼠实施口服灌胃免疫。免疫完成后对各组小鼠的免疫指标进行检测，进而对重组植物乳酸菌的免疫效果进行评价。
[0346]
2.1材料与方法
[0347]
2.1.1材料
[0348]
2.1.1.1试验菌株
[0349]
nc8-psip409-pgsa
’‑
pfpp重组植物乳酸菌、nc8-psip409-pgsa
’‑
pmfpp重组植物乳酸菌、nc8-psip409-pgsa’空载体植物乳酸菌，均由发明人构建。
[0350]
2.1.1.2试验动物
[0351]
北京华阜康有限公司购买spf级6周龄小鼠40只。
[0352]
2.1.1.3试验试剂
[0353]
尼龙筛网购自solarbio公司；蛋白酶抑制剂(pmsf)、红细胞裂解液购自碧云天生物技术有限公司；200目铜网；4％多聚甲醛通用型组织固定液购自biosharp公司；细胞固定/细胞破模试剂盒购自bd公司；流式细胞术相关抗体等相关试剂均由实验室保存或发明人配置。
[0354]
2.1.2方法
[0355]
2.1.2.1实验动物分组及免疫方案
[0356]
2.1.2.1.1免疫分组
[0357]
将小鼠随机分为pbs组、nc8-psip409-pgsa'、nc8-psip409-pgsa
’‑
pfpp和nc8-psip409-pgsa
’‑
pmfpp组，共4组，每组10只。动物免疫方案及分组如表(表2)。
[0358]
表2动物免疫方案及分组
[0359][0360]
2.1.2.1.2免疫程序
[0361]
四组都在第1、2、3天为一次免疫，第11、12、13天为二次免疫，21、22、23天为三次免疫，每三天采粪。在第10天、第20天、第30天采血、进行流式细胞术检测，免疫程序如图8所示。
[0362]
2.1.2.2流式实验
[0363]
实验步骤：首先对重组植物乳杆菌进行计数，当菌量达到1x109cfu/ml时，对小鼠进行口服免疫，保证每次灌胃无溢出。在第10天，各组取3只小鼠，进行流式检测。步骤如下：
[0364]
(1)分别对小鼠采取眼球采血、处死。
[0365]
(2)在超净台中，分别取小鼠的脾脏、pp结、肠系膜淋巴结mln至于冰上。
[0366]
(3)研磨脾，在铜网中加1ml完全培养基，研磨后吸到1.5ep管中，在水平离心机中2000rpm、4℃离心5min，弃上清。用1ml pbs洗一遍弃上清后加1ml完全培养基。
[0367]
(4)mln在铜网中加1ml完全培养基，研磨后吸到1.5ep管中，在水平离心机中，4℃，2000rpm离心5min，用1ml pbs洗一遍之后弃上清加入1ml完全培养基。
[0368]
(5)研磨pp结时，在铜网中加入1ml完全培养基，研磨后吸到1.5ep管中，水平离心机4℃，2000rpm离心，5min，使用1ml pbs洗一遍弃上清加1ml完全培养基。
[0369]
(6)细胞计数：在冰上，将脾细胞原液100倍稀释(10μl加900μl pbs)、mln细胞20倍稀释(50μl加950μl pbs)、pp结细胞20倍稀释(50μl加950μl pbs)，然后通过血细胞计数板进行计数，计算出1x106的细胞需要多少μl原液。
[0370]
(7)抗体的稀释：分别对流式抗体b220
+
iga、cd11
+
、cd80
+
cd86
+
、cd3 cd4 cd8/ifn-y il-4进行稀释，避光、置于冰上。
[0371]
(8)pp表面(发生中心)iso单标b220
+
iga，b220
+
(apc，110x)，iga(fitc，40x)，pp细
胞内：100μl样加b220apc 10μl，4℃避光20min，1％bsa的pbs洗一次，离心弃上清，加250μl甲醛固定液，4℃避光20min，加800μl穿膜液混匀(用哇哈哈1：9稀释)，立即离心，弃上清，第二次加1ml穿膜液，室温避光静置5min，离心弃上清(不用pbs洗)，剩100μl直接加iga+fitc，(40倍稀释)，避光4℃孵育20min，孵育后离心弃上清，用1ml pbs洗一遍，加入250μl lpbs混匀。过膜上机。
[0372]
(9)cd11c
+
，(apc，40x)、cd80
+
，(fitc，60x)、cd86
+
，(pecy7，40x)，10μl样+各加10μl共30μl(可提前将三种稀释后的抗体混在一起)。4℃避光20min，1ml的pbs洗一遍，弃上清，加入250μl lpbs混匀。过膜上机。
[0373]
(10)mln，spleen(24孔板)iso单标cd3 cd4 cd8/ifn-y、il-4，分别取2x106/孔的细胞铺于48孔板中，然后加入离子霉素(1：10)、pma(1：100)、阻断剂(1：40)，刺激6h，将细胞洗下于1.5ml离心管中，分别加入抗体cd3 cd4 cd8，4℃避光20min，1％bsa的pbs洗一次，离心弃上清，加250μl甲醛固定液，4℃避光20min，加800μl穿膜液混匀(用哇哈哈1：9稀释)，立即离心，弃上清，第二次加1ml穿膜液，室温避光静置5min，离心弃上清(不用pbs洗)，剩100μl直接加iga
+
fitc，(40倍稀释)，避光4℃孵育20min。孵育后离心弃上清，用1ml pbs洗一遍，弃上清，加入250μl lpbs混匀。过膜上机。
[0374]
2.1.2.3 elisa实验
[0375]
2.1.2.3.1粪便中分泌型siga的检测
[0376]
对采集的粪便进行处理，在粪便中加入粪便重量三倍的pmsf蛋白抑制剂对粪便进行处理，4℃过夜，3000rpm离心10min，吸取上清备用。对粪便中的分泌型siga检测方法如下：
[0377]
(1)包被抗原，将纯化好的蛋白抗原用包被缓冲液稀释至3μg/ml，在96孔板中，每孔100μl，密封，4℃过夜；
[0378]
(2)洗板，向96孔板中每孔加入300μl的pbst，洗板5次，每次3-5min。轻轻震荡，拍干；
[0379]
(3)封闭，每孔加入300μl的封闭液，封膜，37℃，1h；
[0380]
(4)洗板，向96孔板中每孔加入300μl的pbst，洗板5次，每次3-5min，轻轻震荡，拍干；
[0381]
(5)加入一抗，一抗为上面制备的粪便上清液，分别对粪便上清液进行梯度稀释、封膜、37℃，1h；
[0382]
(6)洗板，向96孔板中每孔加入300μl的pbst，洗板5次，每次3-5min。轻轻震荡，拍干；
[0383]
(7)加入酶标二抗，二抗使用抗鼠的siga抗体(1：100000稀释)，封膜，37℃，1h；
[0384]
(8)洗板，向96孔板中每孔加入300μl的pbst，洗板5次，每次3-5min，轻轻震荡，拍干；
[0385]
(9)底物显色，每孔加入100μl的底物显色液，37℃，10min；
[0386]
(10)终止反应，向每孔加入50μl的种植液(终止液为2m的浓硫酸)；
[0387]
(11)酶标仪检测结果，在酶标仪内，检测波长450nm，震板30s，读数；
[0388]
(12)结果判误：若待测孔od＞0.1且大于阴性对照孔的2.1倍(p/n＞2.1)p:待测样品，在某一稀释倍数测定的od值，n：为阴性样品，在相应稀释倍数的测定的od值，判定为阳
性。以判定为阳性的样品最高稀释倍数为抗体效价。
[0389]
2.1.2.3.2血清中igg的检测
[0390]
对眼球采到的血，放在37℃，温箱中孵育4h后，5000rpm离心10min，吸取析出的血清备用。对血清中igg的测定方法如下：
[0391]
(1)包被抗原，将纯化好的蛋白用包被缓冲液稀释至3μg/ml，在96孔板中，没孔100μl，密封，4℃过夜；(2)洗板，向98孔板中每孔加入300μl的pbst，洗板5次，每次3-5min，轻轻震荡，拍干；(3)封闭，每孔加入300μl的封闭液，封膜37℃，1h；(4)洗板，向86孔板中每孔加入300μl的pbst，洗板5次，每次3-5min，轻轻震荡，拍干；(5)加入一抗，一抗为上面制备的血清，分别对血清进行稀释，封膜，37℃，1h；(6)洗板，向86孔板中每孔加入300μl的pbst，洗板5次，每次3-5min，轻轻震荡，拍干；(7)加入酶标二抗，二抗使用抗鼠的igg抗体(1：100000稀释)，封膜，37℃，1h；(8)洗板，向86孔板中加入300μl的pbst，洗板5次，每次3-5min，轻轻震荡，拍干；(9)底物显色，每孔加入100μl的底物显色液，37℃，1h；(10)终止反应，每孔加入50μl的终止液(终止液为2m的浓硫酸)；(11)酶标仪检测结果，在酶标仪内，检测波长450nm，震板30s，读数；(12)结果判误：若待测孔od＞0.1且大于阴性对照孔的2.1倍(p/n＞2.1)p:待测样品，在某一稀释倍数测定的od值，n：为阴性样品，在相应稀释倍数的测定的od值，判定为阳性。以判定为阳性的样品最高稀释倍数为抗体效价。
[0392]
2.1.2.3.3 cck-8比色法检测t淋巴细胞增殖96孔板
[0393]
(1)将脾淋巴结细胞以5x105个/孔均匀的铺在96孔板中；(2)设置只有prmi1640完全培养基的空白对照组(后面也加cck8)、添加淋巴细胞悬液的实验组。(只加细胞，不加刺激物三孔)每组三个重复孔，(96孔板最外围加入pbs保持环境湿度。共87孔，剩余孔加培养基)；(3)每孔加入10μl浓度为10μg/ml的cona或蛋白，混匀后置于37℃，5％co2培养箱中培养44h；(4)小心取出培养基上清，加入90μl新鲜的prmi1640完全培养基，再加入10μl cck-8溶液继续37℃，5％co2条件下培养4h；在读取平板之前，可以在摇床上温柔的混匀。然后使用酶标仪测量450nm处的吸光度；(5)计算刺激指数si[(实验组a值-空白对照组a值)/(pbs对照组a值-空白对照组a值)]。
[0394]
2.2结果
[0395]
2.2.1流式细胞术结果
[0396]
2.2.1.1重组植物乳酸菌对免疫后小鼠脾脏中细胞因子的影响
[0397]
为了检测免疫反应，在免疫一周后使用流式细胞术对小鼠脾脏中的cd4
+
il-4
+
和cd8
+
ifn-γ
+
细胞进行了检测。结果显示pbs组与pmfpp组相比cd4
+
il-4
+
差异极显著(p《0.001)；pbs组与pfpp组相比cd4
+
il-4
+
差异极显著(p《0.01)；nc8组与pmfpp组相比cd4
+
il-4
+
差异极显著(p《0.01)；nc8组与pfpp相比cd4
+
il-4
+
差异显著(p《0.05)；pbs组与pmfpp组相比cd8
+
ifn-γ
+
差异极显著(p《0.001)；pbs组与pfpp组相比cd8
+
ifn-γ
+
差异显著(p《0.05)；nc8组与pmfpp组相比cd8
+
ifn-γ
+
差异极显著(p《0.01)。结果显示小鼠的脾脏在重组植物乳酸菌作用下能有效地诱导细胞免疫反应，见图9。
[0398]
2.2.1.2重组植物乳酸菌对免疫后小鼠派尔集合淋巴结中b细胞的影响
[0399]
为了检测重组植物乳酸菌对小鼠pp结中b细胞的影响，检测了b220
+
iga
+
。结果显示pbs组与pmfpp组中b220
+
iga
+
差异极显著(p《0.01)；pbs组与pfpp组中b220
+
iga
+
差异极显著(p《0.01)；nc8组与pmfpp组中b220
+
iga
+
差异显著(p《0.05)；nc8组与pfpp组中b220
+
iga
+
差
异显著(p《0.05)。结果显示重组植物乳酸菌有效诱导小鼠pp结中b细胞活化，见图10。
[0400]
2.2.1.3重组植物乳酸菌对免疫后小鼠派尔集合淋巴结树突状细胞活化的影响
[0401]
为了评价重组植物乳酸菌植物乳酸菌对小鼠树突状细胞的影响，给小鼠通过口服灌胃的免疫方式饲喂重组植物乳酸菌，在免疫一周后，检测了派氏淋巴结中树突状细胞表面活化标志cd80、cd86的表达情况。结果显示，pbs组与pmfpp组中cd80差异极显著(p《0.0001)；pbs组与pfpp组中cd80差异极显著(p《0.01)；nc8组与pmfpp组中cd80差异极显著(p《0.001)；nc8组与pfpp组中cd80差异极显著(p《0.01)；pmfpp组与pfpp组中cd80差异显著(p《0.05)；pbs组与pmfpp组中cd86差异显著(p《0.05)；pbs组与pfpp组中cd86差异显著(p《0.05)，以上结果说明重组植物乳酸菌表达非洲猪瘟融合蛋白对小鼠派氏淋巴结树突状细胞有活化效果，见图11。
[0402]
2.3讨论
[0403]
使用两株重组植物乳酸菌nc8-psip409-pgsa
’‑
pfpp与nc8-psip409-pgsa
’‑
pmfpp对小鼠进行了口服灌胃免疫实验，对比pbs以及nc8组，以验证重组植物乳酸菌的免疫效果。
[0404]
2.3.1免疫后各项免疫指标的流式检测
[0405]
免疫一周后，使用流式细胞术对各项指标进行了检测，检测重组植物乳酸菌免疫后对小鼠细胞免疫的影响。结果显示两种重组植物乳酸菌均可以诱导小鼠脾脏产生cd4
+
il-4
+
和cd8
+
ifn-γ
+
细胞，表明重组植物乳酸菌表达的融合蛋白作为诱导机体细胞免疫的抗原，成功诱导了t淋巴细胞的反应，可能两个t细胞亚群均起到保护作用。
[0406]
使用流式细胞术检测了重组植物乳酸菌免疫后小鼠派尔集合淋巴结b细胞中iga的含量，结果显示重组植物乳酸菌中b220
+
iga
+
的数量显著高于pbs和nc8组，表明在重组植物乳酸菌的刺激下抗体分泌量显著增加，成功活化了b淋巴细胞的反应。
[0407]
树突状细胞受到抗原刺激后会分化并分别产生cd80
+
和cd86
+
分子，所以本实验检测了派尔集合淋巴结树突状细胞中的cd80
+
和cd86
+
分子，两种重组植物乳酸菌在口服灌胃后均能够刺激派尔集合淋巴结中cd80
+
和cd86
+
表面标志的活化，表明两种重组植物乳酸菌均能够使树突状细胞活化，使其进一步发挥其抗原摄取呈递功能。其中，猪源igg3 fc片段突变组nc8-psip409-pgsa
’‑
pmfpp的免疫效果优于未突变组nc8-psip409-pgsa
’‑
pmfpp，这可能是因为猪源fcγ不能与鼠fcγr结合。
[0408]
2.4小结
[0409]
通过灌胃的方式免疫小鼠，两株重组植物乳酸菌能更好的刺激dc细胞的活化，诱导小鼠产生细胞因子，促进t细胞增殖，提高b细胞的活化水平，为生发中心的形成提供了条件，并促进了iga的表达。
[0410]
实施例3
[0411]
重组植物乳杆菌的构建及蛋白表达验证与纯化
[0412]
1.1材料
[0413]
1.1.1质粒
[0414]
以非洲猪瘟病毒毒株ba71v为参考序列，选取毒株中编码p14.5蛋白基因(e120r)序列，由南京金斯瑞巴西vs瑞士让球有限公司按照植物乳杆菌表达密码子优化合成。同时将两种佐剂序列优化后分别置于e120r基因5'3'端(cta1-dd)与3'端(il-33)，p14.5，cta1-p14.5-d-d，p14.5-il-33-mus序列合成后插入以erm为筛选标记单锚定表达载体plp-s中，得到三
个质粒plp-s-p14.5，plp-s-p14.5-il-33以及plp-s-cta1-p14.5-d-d。
[0415]
1.1.2菌株及质粒载体
[0416]
nc8乳酸菌由实验室保存，乳酸菌表面展示系统(plp-s)由实验室保存。
[0417]
1.1.3主要试剂
[0418]
限制性内切酶(sali和xhoi)、sppip购于宝生物工程大连有限公司；10
×
h buffer，dna marker(dl-15000、dl-10000)购于takara生物公司；红霉素购于北京索莱宝科技有限公司；质粒小提试剂盒盒购于北京全式金生物公司；电击杯购自bio-rad公司；dna凝胶回收试剂盒购于美国omega bio-tek公司；诱导剂sppip由实验室保存；bca蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物技术公司。
[0419]
1.1.4主要试剂的配制
[0420]
1)lb培养基配方：蛋白胨10g，酵母5g，nacl 10g；
[0421]
先溶于800ml蒸馏水，完全溶解后补充至1l，分装至试管或锥形瓶中，121℃高压灭菌20min备用(液体)。在配好的lb液体培养基中加入1.5％的琼脂粉，121℃高压灭菌20min备用(固体)。
[0422]
2)mrs培养基配方：蛋白胨10g，酵母5g，葡萄糖10g，牛肉蛋白粉10g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，吐温-80 1ml，七水硫酸镁0.2g，一水硫酸锰0.05g；
[0423]
先溶于800ml蒸馏水，完全溶解后补充至1l，用高压锅115℃灭菌15min，调节ph6.2～6.4(液体)。在配好的mrs液体培养基中加入1.5％的琼脂粉，121℃高压灭菌20min备用(固体)。
[0424]
3)50
×
tae电泳缓冲液(ph8.5)配方：tris 242g，na2edta
·
2h2o 37.2g；
[0425]
注意：溶于1000ml蒸馏水中，室温保存即可。
[0426]
4)5
×
sds电泳缓冲液配方：tris 15.1g，glycine 94g，sds 5g；注意：溶于1000ml蒸馏水中，4℃保存。
[0427]
5)tbst配方：nacl 8.8g，1m/l tris-hcl(ph8.0)20ml，去离子水800ml，tween-20 0.5ml；注意：溶于1000ml蒸馏水中，4℃保存。
[0428]
6)转膜液配方：glycine 2.9g，tris 5.8g，sds 0.37g，甲醇200ml，去离子水600ml；
[0429]
注意：溶于1000ml蒸馏水中，4℃保存。
[0430]
7)pbs缓冲液：pbs缓冲剂0.02m，蒸馏水1800ml；注意：121℃高压灭菌后室温保存。
[0431]
8)电转化溶液
[0432]
电击缓冲液：mgcl
2 0.029g、蔗糖34.21g、dh2o 80ml，以稀盐酸将溶液ph调至7.4，加入蒸馏水定容至100ml，121℃灭菌20min，4℃储存备用。
[0433]
清洗缓冲液：na3po
4 0.19g、mgcl
2 0.009g；dh2o 80ml以稀盐酸将ph调至7.4，加入蒸馏水定容至100ml，121℃灭菌20min，4℃储存备用。
[0434]
9)蛋白电泳溶液(5
×
running buffer)：tris粉末7.575g，甘氨酸粉末35.1g，sds粉末2.5g，加dd h2o溶解均匀，最后定容至500ml，以1:5(v/v)使用。
[0435]
10)30％丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺87.6g，甲叉双丙烯酰胺2.4g，加dd h2o溶解混匀定容至300ml，褐色瓶盛装并避光保存。
[0436]
11)1.5mtris-cl，ph 8.8：tris粉末56.013g加入dd h2o中混匀，缓慢滴加1m hcl
调节溶液ph至8.8，最终dd h2o定容至300ml。
[0437]
12)0.5m tris-cl，ph 6.8：tris粉末36.342g加入dd h2o中混匀，缓慢滴加1m hcl调节溶液ph至6.8，最终ddh2o定容至300ml。
[0438]
13)10％aps溶液：aps(过硫酸铵)粉末0.3g，加入dd h2o溶解混匀定容至5ml，分装(500μl/份)并于-20℃中冻存备用。
[0439]
14)碱性磷酸酶(ap)缓冲液：nacl 0.58g，mgcl2·
6h2o 0.11g，tris 1.21g，加入dd h2o搅拌混匀并定容至100ml，4℃存放备用。
[0440]
1.2方法
[0441]
1.2.1目的基因p14.5、il-33-mus、cta1-dd的序列获取
[0442]
通过ncbi获得p14.5与il-33-mus的核苷酸序列及氨基酸序列，通过文献查询获得cta1-dd的核苷酸序列及氨基酸序列。
[0443]
1.2.2质粒的构建
[0444]
南京金斯瑞巴西vs瑞士让球有限公司按照植物乳杆菌表达密码子优化p14.5，cta1-p14.5-d-d，p14.5-il-33-mus序列，合成后插入以erm为筛选标记单锚定表达载体plp-s中，得到三个质粒plp-s-p14.5，plp-s-p14.5-il-33以及plp-s-cta1-p14.5-d-d。
[0445]
1.2.3质粒双酶切及测序鉴定
[0446]
(1)质粒样品送至吉林省库美生物技术公司进行测序鉴定。
[0447]
(2)15μl酶切鉴定体系如下：质粒10.5μl，酶sali 1.5μl，酶xhoi 1.5μl，buffer 1.5μl。
[0448]
1.2.4酶切产物凝胶电泳试验
[0449]
将酶切产物取1-10μl混上10
×
的loading buffer 2μl加入琼脂糖凝胶孔中，在120v/20min的条件下进行电泳试验，电泳结束后取下凝胶放入照胶台，经台式紫外成像分析仪器可见大小与预期是否相符。
[0450]
1.2.5植物乳杆菌nc8感受态的获得
[0451]
(1)取-80℃冻存的植物乳杆菌nc8接种于5ml含erm(5μg/ml)的mrs液体培养液中，置于厌氧工作站中培养；(2)含erm(5μg/ml)的mrs固体培养基上均匀涂抹0.1ml培养后的菌液，置于厌氧工作站中培养至长出单菌落(16-18h)；(3)取5ml erm(5μg/ml)的mrs液体培养基(含2％gly)接种固体平板上的单菌落，置于厌氧工作站中培养直至菌液od600值为0.6-0.8；(4)取50ml含的mrs液体培养基(含2％gly，5μg/ml erm)接种培养1ml上述菌液，厌氧条件下继续培养直至菌液od600值为0.3；(5)将上述收集的菌液冰浴10min，4℃条件下8000r/min离心5min，收集菌体沉淀；(6)将菌体沉淀以冰冷的2ml清洗缓冲液重悬，4℃条件下8000r/min离心10min，重复清洗两次，收集菌体沉淀；(7)将菌体沉淀以冰冷的200μl电击缓冲液重悬，冰浴10min后以每管100μl进行分装，液氮速冻后置于-80℃冰箱备用。
[0452]
1.2.6将质粒电转化至植物乳杆菌nc8中
[0453]
(1)分别取5μl重组质粒plp-s-p14.5、plp-s-p14.5-il-33-mus、plp-s-cta1-p14.5-d-d加入三管冰浴的100μl乳酸菌nc8感受态中，轻缓混匀，移入电击杯内，静置冰浴5min后，放入电转化仪(2.5kv，6ms)中进行电击；
[0454]
(2)完成电击后，继续冰浴3-5min，取800μlmrs培养液加入电击杯中，混匀后将电击杯内液体全部吸出至1.5ml的离心管中，封口膜封口后，置于厌氧工作站培养2h；
[0455]
(3)取出ep管，4000rpm，离心3min，弃去上清液，留100μl用无菌的涂布棒均匀涂布于含erm(5μg/ml)的mrs固体培养基上，厌氧培养直至长出大小合适的单菌落，约16-20h。
[0456]
1.2.7重组植物乳杆菌质粒的提取及鉴定
[0457]
将固体培养基中乳酸菌单菌落接种于含erm(5μg/ml)的5mlmrs培养液中，厌氧条件下培养16-20h，用质粒小量提取试剂盒(使用溶菌酶破壁)进行质粒提取。提取的质粒使用sali/xhoi进行双酶切，凝胶电泳鉴定质粒是否成功转入乳酸菌nc8中。
[0458]
1.2.8重组植物乳杆菌菌生长曲线测定
[0459]
a.将nc8-plp-s-p14.5，nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus和nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d分别划线于加入em抗性的平板上，于37℃厌氧箱中培养16h后，选取大小适中的单菌落挑菌到5ml加入em抗性的mrs试管中过夜活化培养；b.取活化的nc8菌液1:30接菌于50ml加入em抗性的离心管中；待三组菌液od值都为0.3-0.4之间时，加入乳酸菌诱导剂sppip(12.5μl/5ml)；c.每间隔1h从各组菌液中分别取2ml测od600值，进行12小时的监测并绘制生长曲线。
[0460]
1.2.9菌落滴板计数
[0461]
经多次检测，当培养12h时nc8-plp-s、nc8-plp-s-p14.5、nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus和nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d菌液的od值分别为2.09、1.64、1.42和1.59。分别梯度稀释106，107，108后取100μl进行滴板计数，总结发现0.1ml的nc8-plp-s-p14.5有5.5
×
109个菌落数；0.5ml的nc8-plp-s-p14.5有1
×
109个菌落数；0.8ml的nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus有1
×
109个菌落数；1.1ml的nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d有1
×
109个菌落数(小鼠饲喂乳杆菌最佳数量为0.5
×
10
9-1
×
109)
[0462]
1.2.10重组植物乳杆菌的westen blot检测
[0463]
(1)蛋白样品处理
[0464]
a.将保藏的菌液nc8-plp-s-p14.5，nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus和nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d从-80℃冰箱中取出，接种于5ml含erm(5μg/ml)的mrs液体，过夜培养；b.次日转接至50ml加入erm(5μg/ml)的mrs液体中，37℃厌氧工作站培养1h后分别加入sppip 125μl(50mg/ml)，诱导培养6h后，离心取沉淀用pbs洗3遍后分别用5ml pbs重悬；c.将样品在60w的条件下超声破碎处理20min，将细菌上清液和沉淀分别收集于ep管中。
[0465]
(2)western blot
[0466]
a.首先配置凝胶；b.nc8-plp-s-p14.5，nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus和nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d分别取10μl菌液加5μl的5
×
上样缓冲液于100℃沸水中煮10min；c.将样品加入胶槽内，上层胶用80v跑45min，下层胶用150v跑30min；d.转膜预先将转膜滤纸在转膜液中浸润，取出凝胶，根据所需大小剪下一块大小合适的nc膜，注意边缘整齐，甲醇中浸泡30s激活后，再浸泡于转印缓冲液中；e.在转膜液中按照从上到下依次为海绵、滤纸、nc膜、凝胶、滤纸、海绵的顺序排放好于转印夹中，注意白色一侧在上，黑色在下，用小滚轮除去每层之间产生的气泡，nc膜一侧与正极相连，凝胶一侧与负极相连，恒流300ma/1h，转膜过程全程在冰上进行；f.封闭：取出nc膜，加入1
×
pbs迅速清洗一遍，目的是洗掉多余的电转液。再加入pbst溶液，室温封闭1h；g.抗体孵育：弃掉封闭液，1
×
pbst清洗两遍，1
×
pbs清洗一遍，5min/遍，洗掉多余的封闭液。加入适量的抗体稀释液中，置于摇床上4℃孵育过夜；h.ect显色：将ect显色试剂盒的a液与b液按照1:1比例混合均匀后，均匀涂抹于nc膜上放入
ai 600仪器中进行显色，并获取图像结果。
[0467]
1.2.11构建重组大肠杆菌bl21-pet-28a-p14.5
[0468]
(1)引物设计
[0469]
为得到带有酶切位点nco i和xho i的p14.5基因片段设计上下游引物进行pcr扩增，在asfv p514.5序列上游5'端添加nco i酶切位点。
[0470]
f：5'catgccatgggtcgacatggctgattttaattcaccc 3'
[0471]
r：5'ctcgaggtggtgatggtggtggtg 3'
[0472]
(2)pcr扩增
[0473]
pcr扩增体系如下：质粒(p14.5-plp-s)1μl，primestar max 25μl，p14.5 f 2μl，p14.5 r 2μl，ddh2o 20μl，总共50μl；
[0474]
pcr反应程序见表3
[0475]
表3
[0476][0477]
步骤2-4重复35个循环；
[0478]
(3)胶回收
[0479]
扩增片段大小为402bp，胶回收。
[0480]
(4)连接peasy-blunt-zero，转化至t1感受态中
[0481]
a.将胶回收产物与载体4:1混合，即4μl pcr产物，1μl载体，在16℃条件下使用t4连接酶进行连接；b.将连接产物小心的加到t1感受态(冰上溶解)中，轻弹混匀后放置冰上30min；c.42℃水浴锅热激90s后置于冰上静置5min；d.向t1感受态中加入300μl平衡至室温的液体lb，37℃摇床培养1h；e.取出培养后的菌液，4000rpm离心5min，弃上清留100μl悬浮菌体沉淀后均匀涂抹在加入kana抗性的lb平板上，将平板倒置于37℃温箱培养；
[0482]
(5)挑菌鉴定质粒，酶切回收目的片段
[0483]
a.从平板上挑取单菌落加入kana抗性的液体lb试管中过夜培养，提取质粒进行双酶切鉴定和测序鉴定；
[0484]
b.将双酶切后回收的目的片段与-20℃冰箱中保存；
[0485]
(6)目的片段连接pet28a表达载体并转化至bl21(de3)感受态
[0486]
4.5μl的目的片段(胶回收产物)加0.5μl的pet-28a表达载体在16℃水浴锅过夜连接，将连接产物普转转入bl21(de3)感受态中，涂板于带有kana抗性(50mg/ml)的固体lb平板上；选取平板上大小适中的单菌落，挑菌至液体lb中培养，提取质粒，双酶切测定，送样质粒测序。
[0487]
1.2.12p14.5蛋白的纯化
[0488]
a.接菌bl21-pet-28a-p14.5，从-80℃取出保存的菌在5ml的kana抗性的lb培养基中培养8h；b.转接，800mlkana抗性的lb液体培养基加入a中菌液10ml，培养至od600＝0.6-0.8；c.诱导，菌液中加入iptg(200mg/ml)诱导剂250μl诱导表达4h；d.离心，将诱导后菌液
1000rpm离心10min，5ml pbs重悬菌体沉淀；e.超声破碎后，10000rpm，4℃条件下离心20min，收集沉淀(收集部分上清留作检测)；f.用2m尿素pbs洗一次、用4m尿素pbs洗一次、用8m尿素pbs洗一次，用0.22μm除菌过滤器过滤；
[0489]
g.离心取上清液，沸水煮样处理10min；
[0490]
h.跑western，将胶用0.25m kcl处理，切胶至碎块状，用pbs浸泡7-8h；离心，吸取上清。
[0491]
1.3结果
[0492]
1.质粒plp-s-p14.5，plp-s-p14.5-il-33以及plp-s-cta1-p14.5-d-d的核苷酸序列分别如seq id no.3-5所示；
[0493]
2.质粒plp-s-p14.5，plp-s-p14.5-il-33以及plp-s-cta1-p14.5-d-d的氨基酸序列分别如seq id no.6-8所示；
[0494]
3.质粒plp-s-p14.5，plp-s-p14.5-il-33以及plp-s-cta1-p14.5-d-d鉴定
[0495]
将合成的质粒用salⅰ和xhoⅰ双酶切分别得到载体和目的片段，如图12、图13、图14所示。
[0496]
4.质粒图谱
[0497]
成功构建好的nc8-plp-s-p14.5如图15所示，nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus如图16所示，nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d如图17所示。
[0498]
5.p14.5扩增pcr结果
[0499]
p14.5基因pcr扩增产物核酸电泳验证，扩增基因片段大小为402，如图18所示；
[0500]
6.构建成功的bl21-pet-28a-p14.5酶切鉴定结果
[0501]
将构建好的bl21-pet-28a-p14.5取质粒用xhoⅰ和ncoⅰ进行双酶切，结果与预期相符；如图19所示。
[0502]
7生长曲线测定以及最佳稀释倍数菌落计数
[0503]
nc8-plp-s、nc8-plp-s-p14.5、nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus、nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d的生长曲线测定结果(12h)以及多次菌落滴板计数测定结果进行滴板计数结果选择12h为最佳饲喂时间点(即加入诱导剂sppip后8h)。菌株生长曲线如图20所示。
[0504]
实施例4
[0505]
重组植物乳杆菌的动物实验
[0506]
实施例1已经成功构建了三株重组植物乳杆菌并且体外锚定表达成功，该实施例选择小鼠c57bl/6作为实验动物进行初步动物实验，通过口服饲喂的方式免疫小鼠，通过流式细胞术，淋巴细胞增殖试验，elisa等检测免疫小鼠的体液免疫，细胞免疫，粘膜免疫等方面的变化，从而研究新功能型乳酸菌对于免疫动物的免疫力提升作用。
[0507]
2.1材料
[0508]
2.1.1菌株
[0509]
nc8-plp-s-p14.5、nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus、nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d由实施例1获得；
[0510]
2.1.2实验动物
[0511]
5-6周龄的spf级别的雌性c57bl/6小鼠50只购自北京华阜康巴西vs瑞士让球股份有限公司；于吉林农业大学创新大楼spf级别饲养室饲养，适应环境1周后进行试验。
[0512]
2.1.3主要试剂
[0513]
小鼠耳标器、剪刀、镊子、1.5ml ep管、灌胃针小号、眼球采血管、pbs、24孔细胞培养板、96孔酶标elisa检测板、细胞1640培养液均购自北京全式金生物公司；流式抗体cd3、cd4、cd8、cd11、cd80、cd86、b220、iga、ifn-γ、il-4均购自bd公司。
[0514]
2.1.4主要仪器
[0515]
低温超速离心机(eppendorf 5810r)；sw-cj-2fd型单面双人超净工作台(上海博迅)；hrlm-80型全自动高压灭菌锅、bcd-649wdce型冰箱(海尔公司)；g70d20cn1p-d2(s0)20l型微波炉(中国格兰仕)；innova 40r型恒温摇床(美国nbs).
[0516]
2.2方法
[0517]
2.2.1实验分组
[0518]
将50只小鼠随机分成5组，每组10只。每组分别饲喂pbs，nc8-plp-s，nc8-plp-s-p14.5，nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus，喂nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d，在每只小鼠右耳上标号，每组标10个自然数字号码。
[0519]
2.2.2乳酸菌饲喂
[0520]
由实施例3的1.3.7已知最佳饲喂条件，同方法进行接种培养，通过口服的方式将新功能型重组植物乳杆菌对小鼠进行饲喂。
[0521]
2.2.3眼球静脉采血
[0522]
用静脉取血针找好小鼠眼角位置，轻柔旋转进针，待出血后引流入1.5ml ep管中，取0.2ml血液即可。
[0523]
2.2.4粪便收集
[0524]
每三天进行一次粪便的收集。
[0525]
2.2.5单细胞悬液制备方法
[0526]
在超净台中，用眼科剪，眼科镊(已高压灭菌)剥离肠系膜淋巴结(mln)、派依氏集合淋巴结(pp)和脾脏，将多余的脂肪摘除。将叠好的200目无菌滤网后放置于无菌小平皿中，加入1ml rpmi-1640培养液。将脾放入滤网中，用无菌1ml注射器末端轻轻研磨，直到研磨充分后，将液体吸到1.5ml ep管中，放入预冷的离心机中，4℃，2000rpm，离心5min。然后弃上清，加0.5ml红细胞裂解液，冰上裂解3min后加0.5ml pbs混匀静止2min。2000rpm，4℃离心5min，弃上清。1ml pbs洗1遍弃上清加1ml完全培养基。稀释100倍后细胞计数板计数。mln、pp结以同样的方式处理，但不需要用红细胞裂解液裂解。处理后，稀释20倍进行计数。
[0527]
2.2.6抗体染色
[0528]
染色方法详见流式抗体染色说明书。
[0529]
2.2.7流式上机
[0530]
2.2.8 elisa检测
[0531]
检测粪便中分泌型siga和血清中igg。
[0532]
(1)包被：在96孔培养板的每个样品孔包被纯化后的p14.5抗原(浓度为1μg/ml)，每孔100μl，4℃条件下静置过夜；(2)洗涤：每个样品孔加含0.05％吐温-20的pbs室温下洗涤，300μl/孔，每5min洗涤一次，共三次；(3)封闭：每个样品孔加入含有1％bsa的pbs，4℃封闭过夜，150μl/孔；(4)洗涤：重复步骤2；(5)一抗：加入待检测的样品(粪便与血清处理后的样品)，封膜；(6)洗涤：重复步骤2；(7)二抗：二抗为稀释后的抗鼠siga与抗鼠的igg，封膜；
(8)洗涤：重复步骤2；(9)底物显色，加入显色液100μl/孔，37℃条件下避光反应1h；(10)终止反应：添加终止液10％h2so4，50μl/孔；(11)酶标仪检测结果，检测波长为450nm，保留数据；(12)分析结果。
[0533]
2.2.9cck-8比色法检测t淋巴细胞增殖96孔板
[0534]
1、制备细胞悬液：细胞计数；2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数(约1-2
×
104)，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复；3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去；4、加入10μl cck8：由于每孔加入cck8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10％cck8的培养基(现用现配)，以换液的形式加入；5、培养0.5-4小时：细胞种类不同，形成的formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件(建议预实验先摸清楚时间点)。特别是血液细胞形成的formazan很少，需要较长的显色时间(5-6小时)；6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。
[0535]
2.3结果
[0536]
2.3.1流式细胞术检测结果
[0537]
2.3.1.1脾脏淋巴细胞中cd3
+
cd4
+
t细胞中il-4、ifn-γ和cd3
+
cd8
+
t细胞中il-4、ifn-γ的含量显著上升
[0538]
脾脏是主要的外周免疫器官，是t细胞和b细胞定居的场所，同时也是体内产生抗体的主要器官，在机体的防御、免疫应答中具有重要地位。cd3、cd4、cd8是淋巴细胞的表面标志，可以标记细胞毒性t细胞和辅助性t细胞。il-il-4主要由活化t细胞产生，对于b细胞、t细胞、肥大细胞、巨噬细胞和造细胞都有免疫调节作用，ifn-γ具有抗病毒，抗肿瘤和免疫调控的作用，同时可以促进nk细胞活性，促进抗原呈递和提高巨噬细胞溶酶体活性。
[0539]
重组植物乳杆菌增强了对机体的免疫效果，脾脏淋巴细胞中cd3
+
cd4
+
t细胞中il-4、ifn-γ和cd3
+
cd8
+
t细胞中il-4、ifn-γ的含量显著上升；如图21-25所示。
[0540]
2.3.1.2派依氏集合淋巴结(pp)细胞中11c
+
80
+
和11c
+
86
+
含量的变化
[0541]
派尔集合淋巴结(peyer patch)，又称peyer斑、派尔斑、pp结、肠道集合淋巴结，peyer patch等，是肠黏膜免疫系统的重要组成部分，是小肠粘膜内的一组淋巴滤泡。
[0542]
淋巴滤泡由b细胞和t细胞(cd4为主)组成，在其表面覆盖着一层微皱褶细胞，又称m细胞。它能识别胃肠道内呈现的许多抗原，主要吞噬病毒和肠道病原菌，递呈吞入的肠腔内抗原转交给免疫细胞，免疫细胞可对致病抗原加工、转运、呈递。在此过程中被激活的免疫细胞经过循环归巢的过程回到肠黏膜固有层，成为分泌iga为主的浆细胞和效应t细胞参与肠道局部免疫反应。主要存在回肠部位。
[0543]
cd80是cd86活化t淋巴细胞时的协同刺激因子，在自身免疫监控、体液免疫应答及移植反应中发挥重要作用。cd86与诱导剂cd28和抑制剂ctla4相互作用，是诱导t淋巴细胞增殖及产生il-2的主要协同因子。
[0544]
重组乳杆菌显著增强pp中11c
+
80
+
和11c
+
86
+
的表达；如图26和27所示。
[0545]
2.3.1.3派依氏集合淋巴结(pp)细胞中b220
+
和iga
+
含量的变化
[0546]
pp是宿主小肠的次级淋巴器官，聚集了b细胞、m细胞等各种细胞，其中m细胞在抗原的摄取过程中发挥了重要的作用。pp存在于从粘膜到粘膜下层，b细胞位于生发中心，t细
胞则在其周围。其中pp承担监控肠腔抗原的粘膜免疫反应的任务，b220和iga是b细胞活化标志，所以pp中活化b细胞的水平是评价机体免疫的重要指标。
[0547]
重组乳杆菌显著增强pp中b220
+
iga
+
的表达；如图18所示。
[0548]
2.4实施例1成功构建了nc8-plp-s-p14.5，nc8-plp-s-p14.5-il-33-mus和nc8-plp-s-cta1-p14.5-d-d，并验证了它们在体外的成功表达。由于乳酸菌可以在小鼠肠道内定殖，并能在肠道环境下可以刺激乳酸菌表达p54蛋白以及p54-il-33、cta1-p14.5-d-d融合蛋白，机体t细胞识别p54蛋白以及p54-il-21融合蛋白并产生特异性的抗体。用小鼠进行初步动物试验，结果可见饲喂重组植物乳杆菌对于小鼠的免疫效果具有一定的提升作用。
[0549]
由流式细胞术实验可见饲喂重组植物乳杆菌组小鼠的pp结淋巴细胞中b220和iga的分泌的量以及11c
+
cd80和11c
+
cd86的含量大于对照组；脾脏中cd4
+
ifn-γ
+
cd4
+
il-4和的cd8
+
ifn-γ
+
cd8
+
il-4表达量也有显著的增强。
[0550]
以上一系列实验结果都表明了当饲喂新功能型重组植物乳杆菌后，小鼠的免疫力有显著的提高。
[0551]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。