非血液来源ctDNA分析的优势与挑战！

作者：张馨予

在过去十几年中，各种液体活检技术已成为传统组织活检样本分析的可行替代方案。通过对生物体液中的生物标志物进行分析，液体活检能够以微创，快速，可重复采样的方式获取有关疾病诊断，预后，及预测的临床信息。

迄今为止，大多数液体活检研究都集中在基于血液的生物标志物上，主要使用血浆衍生的循环肿瘤 DNA（ctDNA）。然而，ctDNA 也可以从各种非血液来源（包括尿液，脑脊液，胸腔积液等）获得，这些非血浆来源 ctDNA 可能在某些应用环境中具有独特的优势。2022年8月1日，来自英国曼彻斯特大学Natalie Cook团队在 Nature Reviews Clinical Oncology杂志上发表了题为“ Circulating tumour DNA — looking beyond the blood”的综述，总结了非血液来源ctDNA分析的研究现状，讨论了替代来源ctDNA的优势，及其与血浆ctDNA之间的互补关系，同时考虑了非血液来源ctDNA测定的技术方法问题，并进一步探讨了将替代测定从实验室向临床转化的一些挑战 [1] 。

非血液来源ctDNA分析的优势与挑战！

文章要点：

基于血浆的循环肿瘤 DNA（ctDNA）检测可以提供有关患者癌症状态的宝贵信息；然而，还有许多 ctDNA 替代来源可供使用，它们可能在某些环境中具有独特的优势。

ctDNA 的非血液来源包括尿液、脑脊液、胸膜或腹膜液、唾液、粪便和精液等。

对于特定肿瘤类型或解剖位置，分析非血液来源的 ctDNA 可能比基于血浆的 ctDNA 检测更加灵敏。

临床实施非血液ctDNA检测面临的挑战包括与分析前因素标准化相关的困难、商业化检测产品的缺乏以及获得某些样本类型不可避免的操作侵入性。

非血液来源ctDNA分析的优势与挑战！

图1. 可以使用非血液来源ctDNA分析的不同癌症示例

正文内容：

cell-free DNA（cfDNA）指位于细胞外且可在体液中检测到的 DNA 片段。在血浆中，cfDNA 通常由长度约为 140-170 个碱基对（bp）的双链 DNA 片段组成，这些片段主要来源于白细胞。ctDNA 是指来源于癌细胞的 cfDNA 部分，它通常包含长度小于 145 bp 的链，各种研究证实，血浆 ctDNA 中检测到的基因组改变与肿瘤组织中发现的基因组改变高度一致。ctDNA的释放机制仍然不清楚，各种假设包括由肿瘤细胞凋亡坏死释放，或是由吞噬肿瘤细胞后的巨噬细胞分泌，还有小部分来自循环肿瘤细胞（circulating tumour cells，CTCs）。此外，ctDNA 也可以通过非血液生物体液与肿瘤组织直接接触而产生，因此这些液体可能比血浆含有更高比例的 ctDNA。与从血浆中分离的 ctDNA 相比，来自非血液来源造血细胞的 cfDNA 相对缺乏意味着 ctDNA 可能以更高的相对浓度和更高的变异等位基因频率（VAFs）存在[2]。这种相对缺乏 cfDNA 在量化 ctDNA 和尝试检测由于缺乏由克隆造血产生的背景噪声而以较低相对频率存在的变化时可能是有利的。此外，作者还认为非血源的ctDNA可能更能反映原发肿瘤的特征，或者，更能够表征基因不同的肿瘤细胞群。

ctDNA检测方法包括使用基于数字聚合酶链反应（dPCR）的技术以检测特定的预选突变、靶向下一代测序（NGS）面板（多达1000个基因），甚至包括全外显子组测序或全基因组甲基化状态分析等更为广泛的方法。关于检测选择的考虑同样适用于血浆和非血液来源的 ctDNA。然而，相对于血浆，大多数非血液样本中的高 ctDNA 与 cfDNA 比率表明这些样本可能不太容易被非肿瘤来源的 DNA 稀释。在对某些液体（如尿液）进行采样时，获得更大的样本量、提取和分析更多的 ctDNA 并提高检测灵敏度水平也更为容易。

尿液ctDNA

尿液中的 ctDNA 由两个不同的部分组成。第一种是经肾肿瘤 DNA（trtDNA），它来源于血浆并通过肾小球滤过进入尿液，因此大小有限（通常<250 bp）。在过去，低浓度的 trtDNA 限制了对此类 ctDNA 的分析，而如今这些问题已通过 NGS等现代分析方法得到部分解决。第二部分来源于直接从泌尿道脱落的肿瘤细胞，并且由于不进行肾滤过，可以具有更大的分子量，下文称ucfDNA（Urinary cell- free DNA）。

trtDNA

分析尿液 ctDNA 最显着的优势是能够完全无创地获取样本，在采样过程中无需取血或医疗保健专业人员在场。尿液样本也可能不太容易被白细胞溶解释放的 cfDNA 稀释 ctDNA 影响，因此尿液能够直接评估泌尿系统癌症释放的ctDNA。尽管具有一些理论上的优势，尿液ctDNA检测的发展仍远不及基于血液的ctDNA检测，并且存在一些应予以强调的缺点。首先，trtDNA 必须通过肾小球，这将片段的分子量限制在 <250 bp。其次，肾小球滤过率控制着尿 trtDNA 的积累率，特别是在接受全身抗癌治疗的患者中，其产量会具有很大的不确定性。另一个潜在的缺点是排尿量通常很大，这将对 ctDNA 产生稀释作用，而使用大体积样品对cfDNA进行分离处理往往在技术上也更具挑战性。