10大SNP检测方法汇总分析

作者：杨超月

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，包括碱基的颠换、转换、插入和缺失。它是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。SNP作为第三代分子标记，被广泛应用于分子遗传学、法医物证检验以及疾病诊断和治疗等众多领域。

一、检测方法介绍

1、测序法

Sanger测序是DNA序列分析的经典方法，可直接获取核酸序列信息，是SNP检测的“金标准”。而且，Sanger测序可发现未知的 SNP位点，确定SNP 的突变类型和突变位置，是一种无法替代的最直接、最准确的SNP检测方法。

采用测序法检测SNP时，首先可将含有SNP位点的靶标序列通过PCR扩增形成DNA片段后，再利用Sanger测序获取目标区域的核酸序列，并对SNP位点进行比对，由此即可确定是否存在变异位点。

Sanger测序是基于双脱氧核糖核苷酸(ddNTP)末端终止的方法进行检测的。即在四个单独的反应体系中，分别对应掺入四种带有不同颜色标记的A、T、G、C双脱氧核苷酸，使得核苷酸在某一固定点开始延伸反应，而延伸过程中若掺入ddNTP，则由于碱基上无3’-OH导致延伸无法继续，从而随机在某一特定碱基处终止，形成相差一个碱基的不同系列长度的核酸片段，再利用毛细管电泳分离这些不同长度的核酸片段，最后通过不同碱基标记的颜色读取待测核酸的碱基序列，由此获得目标区域的核苷酸序列。

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2、TaqMan探针法

TaqMan探针是一种双标记、自淬灭的水解探针，其5’和3’末端分别标记荧光基团和淬灭基团，在探针结构完整时两者距离较近，荧光基团的信号可被淬灭。而在PCR扩增过程中，若TaqMan探针与靶标序列完全匹配，探针则可结合在DNA模板上，此时Taq酶延伸至探针位置时，其外切酶活性将切割水解探针，释放荧光基团，使得荧光信号增强。而且，随着扩增产物的增多，荧光信号越来越强，从而可通过仪器实时监测荧光信号的变化过程。

针对双等位基因SNP，可分别设计两种对应的探针，只有探针与模板完全匹配时，在扩增扩增过程中探针可被水解产生较强的荧光信号，而如果探针与靶序列之间存在错配，其荧光强度将会减弱，由此可通过荧光强度检测SNP位点。

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3、ARMS-PCR法

扩增阻滞突变系统PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR,ARMS-PCR)，又称为等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR, AS-PCR)，是基于Taq DNA 聚合酶无法修复引物3’末端的单个碱基错配，从而使得扩增受阻的检测方法。

在扩增过程中，只有当引物3’末端的碱基与SNP位点的等位基因互补配对时，才能正常延伸扩增；而当引物3’末端的碱基与SNP位点的等位基因不互补配对时，则不发生扩增反应，由此对扩增产物进行凝胶电泳或荧光PCR检测，则可确定SNP基因型。

在ARMS-PCR基础上也发展出了一些改良方法，如四引物扩增阻滞突变系统 PCR(tetra-primer amplification refractory mutation system PCR, Tetra-primer ARMS-PCR)。该方法设计了四条引物，其中两条为3’末端位于SNP位点上的内引物，两条引物方向相反，且分属于不同基因型；另外两条为通用外引物，且两条引物与SNP位点的距离应不一样。

这样，在反应过程中，若四条引物均与模板完全匹配，则可扩增出三种长度不一的产物(两条内引物位于同一位点上，无长片段扩增产物形成)；而如果两条内引物中有一条引物与模板不匹配，则只形成两种不同长度的产物，因此，根据电泳后产物大小即可判断基因型。

然而，由于凝胶电泳检测时间较长，而且开盖进行产物分析易造成污染，因此市面上使用ARMS-PCR方法开发的产品，大部分采用了闭管检测的实时荧光PCR。ARMS-PCR法的荧光PCR检测时，同样使用TaqMan探针，只是将SNP位点设计在引物3’末端，因此理论上只有引物3’端与模板完全匹配时，才能形成扩增曲线；但在实际检测时，单个碱基的错配依然可以延伸扩增，只是效率较低。为了提高其特异性，有时需在靠近引物3’末端的位置人为引入错配碱基，以降低非靶标序列的扩增效率。

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4、分子信标法