一种靶向心肌梗死局部的仿生结构的制作方法

作者：张馨予

1.本实用新型提供了一种仿生纳米材料，具体地，涉及一种靶向心肌梗死局部的仿生结构。

背景技术：

2.急性心肌梗死是导致全球死亡的主要原因，目前通过药物和手术等治疗手段及时疏通梗死的冠状动脉。冠状动脉再通后，缺血心肌虽然得以恢复正常灌注，但其组织损伤反而进行性加重，限制了心肌再灌注治疗的获益。这种冠状动脉阻塞后由于缺血心肌血运重建造成的损伤被称为心肌缺血再灌注损伤。如何减轻心肌缺血再灌注损伤带来的恶性影响，提高心肌梗死患者再灌注治疗效果和预后，是治疗心肌梗死患者的重点及热点问题。活性氧自由基的大量生成在心肌缺血再灌注损伤中具有重要作用。
3.大量动物实验和体外研究证实，使用抗氧化剂治疗心肌梗死可有效缓解缺血再灌注损伤，有效减少心肌梗死面积，促进心肌功能的恢复。因此，靶向清除活性氧自由基是缓解心肌缺血再灌注损伤的关键方法。心肌梗死后，巨噬细胞可迅速迁移至梗死部位。而现有抗氧化药物选择性低，半衰期较低，体内利用率较低，疗效不明显。

技术实现要素：

4.本实用新型通过巨噬细胞膜包裹具有强抗氧化特性的聚多巴胺纳米粒,将巨噬细胞的定向迁移能力与聚多巴胺的抗氧化能力相结合,构建一种靶向心肌缺血再灌注损伤部位的仿生纳米药物，实现在心肌缺血再灌注病灶部位的高度蓄积，达到靶向治疗心肌缺血再灌注损伤的功效。
5.本实用新型提供的一种靶向心肌梗死局部的仿生结构，其特征在于：包括核单元、外膜单元；
6.其中，外膜单元包裹核单元；
7.其中，核单元为聚多巴胺纳米粒；
8.所述外膜单元为巨噬细胞膜。
9.进一步地，本实用新型提供的一种靶向心肌梗死局部的仿生结构，其特征在于：所述外膜单元具有双层结构。
10.进一步地，本实用新型提供的一种靶向心肌梗死局部的仿生结构，其特征在于：所述外膜单元，由第一膜层和第二膜层组成；
11.所述第一膜层，包裹核单元；
12.所述第二膜层，包裹第一膜层。
13.进一步地，本实用新型提供的一种靶向心肌梗死局部的仿生结构，其特征在于：所述外膜单元上还具有复数个表面受体。
14.进一步地，本实用新型提供的一种靶向心肌梗死局部的仿生结构，其特征在于：所述表面受体选自清道夫受体、整合素、表面抗原中的一种或几种。
15.本实用新型提供了一种靶向心肌梗死局部的仿生结构的制备方法，其特征在于：将巨噬细胞膜包裹具有强抗氧化特性的聚多巴胺纳米粒。
16.进一步地，本实用新型提供的一种靶向心肌梗死局部的仿生结构的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
17.步骤1.收集巨噬细胞膜囊泡后，通过脂质体挤出器，来回挤压过纳米聚碳酸酯薄膜，反复进行20-100次；
18.步骤2.加入聚多巴胺溶液，反复挤压20-100次；
19.步骤3.收集挤出液体，离心收集沉淀后，使用缓冲溶液重悬。
20.进一步地，本实用新型提供的一种靶向心肌梗死局部的仿生结构的制备方法，其特征在于：所述巨噬细胞膜囊泡与聚多巴胺溶液的体积比为1：0.8-1.2。
21.进一步地，本实用新型提供的一种靶向心肌梗死局部的仿生结构的制备方法，其特征在于：所述巨噬细胞膜囊泡与聚多巴胺溶液的质量浓度比为1： 0.8-1.2。
22.进一步地，本实用新型提供的一种靶向心肌梗死局部的仿生结构的制备方法，其特征在于所述巨噬细胞膜囊泡中蛋白量与聚多巴胺溶液中聚多巴胺的质量比为1：0.8-1.5。
23.进一步地，本实用新型提供的一种靶向心肌梗死局部的仿生结构的制备方法，其特征在于：所述聚多巴胺溶液的制备方法如下所示：
24.步骤1.将多巴胺盐酸盐溶解在去离子水之中；
25.步骤二、在40-60℃剧烈搅拌后，向多巴胺盐酸溶液中加入碱液；
26.步骤三、聚合反应2-8小时，通过离心回收纳米粒子后，将其分散在去离子水之中；
27.步骤四、使用超滤管去除溶液中的离子后，离心收集聚多巴胺；
28.步骤五、将离心获得的聚多巴胺溶于pbs溶液之中。
29.进一步地，本实用新型提供的一种靶向心肌梗死局部的仿生结构的制备方法，其特征在于：所述多巴胺与碱的质量比为4-8：1。
30.进一步地，本实用新型提供的一种靶向心肌梗死局部的仿生结构的制备方法，其特征在于：所述巨噬细胞膜的提取方法如下所示：
31.步骤1.收集巨噬细胞,加入缓冲液重悬；
32.步骤2.研磨细胞后,加入蔗糖溶液与细胞匀浆混合,使蔗糖终浓度为0.01-0.5mol/l；
33.步骤3.离心5-20min，取上清液；
34.步骤4.离心20-40min，弃上清液；
35.步骤5.加入含蔗糖的缓冲液重悬；
36.步骤6.离心20-40min,弃上清液，管底沉淀物即为巨噬细胞膜。
37.进一步地，本实用新型提供的一种靶向心肌梗死局部的仿生结构，其特征在于，具有如下至少一种的用途：
38.a.用于作为靶向心肌梗死局部的药物；
39.b.用于作为缓解心肌梗死纤维化程度的药物；
40.c.用于缓解心肌梗死症状的药物；
41.d.用于经过血液循环进入毛细血管，被细胞以胞饮的方式吸收的药物；
42.e.用于实现在心肌梗死部位有效的蓄积的药物。
43.本实用新型的作用效果：
44.1)相比较传统抗氧化的药物，此仿生纳米物载体可经过血液循环进入毛细血管，被细胞以胞饮的方式吸收，提高了药物的生物利用率；
45.2)经巨噬细胞膜修饰后可实现梗死部位有效的蓄积，副作用较小；
46.3)药物消除半衰期较传统抗氧化药物延长，体内利用率高。
附图说明
47.图1是本实施例的仿生纳米结构的结构示意图。
48.图2是本实施例的仿生纳米结构的合成路线示意图。
49.图3是本实施例的聚多巴胺(pda)和纳米仿生结构的(mpdanps)的粒径图。
50.图4是聚多巴胺(before)和纳米仿生结构的(after)的投射电镜图。
51.图5是心梗后1天sd大鼠心肌梗死标志物的测定；
52.其中，图5a为ck-mb对比图；
53.图5b为ldh对比图；
54.control为对照组，ir为缺血再灌注组，pda为聚多巴胺组，为pda@raw:纳米仿生药物组；
55.统计分析：n＝6,*p《0.05,**p《0.01,and***p《0.001。
56.图6是心梗后30天sd大鼠心肌组织切片天狼星红染色对比图；
57.其中，control为对照组，ir为缺血再灌注组，pda为聚多巴胺组，为pda@raw: 纳米仿生药物组。
具体实施方式
58.本实施例提供的一种靶向心肌梗死局部的仿生结构，如图1所示，由核单元100和外膜单元200组成；
59.其中，外膜单元200包裹整个核单元100；
60.其中，核单元100为聚多巴胺纳米粒；
61.外膜单元200为巨噬细胞膜，该外膜单元200具有磷脂双分子层，其上具有若干表面受体，如：整合素(intergin a4)210，整合素(intergin b1)220，清道夫受体230，表面抗原(cd40)240等。
62.本实施例提供的一种靶向心肌梗死局部的仿生纳米结构的具体合成方法如下(如图2所示)：
63.步骤一、合成聚多巴胺颗粒
64.①
将180mg多巴胺盐酸盐溶解在135ml去离子水之中；
65.②
在50℃剧烈搅拌后，将naoh溶液(790ul,1mol/l)加入多巴胺盐酸溶液之中；
66.③
4h后通过离心(20000rpm,10min)回收nps并分散在去离子水之中；
67.④
使用3000da的超滤管去除pda溶液之中的离子，后再次离心收集，溶于pbs溶液之中。
68.步骤二、提取巨噬细胞膜
69.收集巨噬细胞,加入4℃tm buffer重悬,用研磨细胞后,加入适量1 mol
·
l-1蔗糖与细胞匀浆混合,使蔗糖终浓度为0.25mol
·
l-1。接着进行如下操作:
70.①
4℃,3000g离心10min,取上清液；
71.②
4℃,4000g离心30min,弃去上清液；
72.③
加入4℃含0.25mol
·
l-1蔗糖tm buffer重悬,4℃,4000g离心30min,弃去上清液。管底沉淀物即为巨噬细胞膜。
73.步骤三、巨噬细胞膜包裹纳米颗粒
74.①
收集巨噬细胞膜囊泡后(蛋白量：200ug/ml)，通过脂质体挤出器来回挤压过纳米聚碳酸酯薄膜，反复进行约50次；
75.②
加入同体积200ug/ml的聚多巴胺溶液，再次反复挤压约50次；
76.③
收集挤出液体，50000g离心收集沉淀后使用pbs重悬。
77.关于上述具体实例中，
78.在制备纳米颗粒的过程中，根据实际药物的需要，多巴胺与碱的质量比可以在4-8：1的范围内进行选择。碱液可以为有机碱或者无机碱，优选使用无机碱。
79.在制备提取巨噬细胞膜的过程中，根据实际药物的需要，蔗糖终浓度可以在0.01-0.5mol/l的范围内进行选择，离心的时间也可以根据离心后的形态情况进行5-40min的调整；
80.在制备巨噬细胞膜包裹纳米颗粒的过程中，根据实际药物的需要，巨噬细胞膜囊泡与聚多巴胺溶液的体积比可以在1：0.8-1.2范围内进行选择，质量浓度比可以在1：0.8-1.2范围内进行选择，巨噬细胞膜囊泡中蛋白量与聚多巴胺溶液中聚多巴胺的质量比可以在1：0.8-1.5范围内进行选择。步骤
①
和
②
中，通过脂质体挤出器反复挤压的次数根据挤压后的产品状态可以在20-100次的范围内进行选择。
81.针对上述实施例的仿生纳米药物，在本实施例中对其性能还进行了如下验证试验：
82.性能验证试验一、心梗后1天sd大鼠心肌梗死标志物的测定。
83.a.比色法检测血清ldh步骤如下：
84.1、分别向空白管，标准管及对照管中加入双蒸水35μl，25μl，25μl；
85.2、向标准管中加入10μl标准液，测定管和对照管中分别加入10μl待测样品；向各管中加入125μl基质缓冲液，仅向各测定管中加入25μl辅酶ⅰ应用液。漩涡混匀器充分混匀，置入37℃水浴中15分钟；
86.3、向各管中加入2,4-二硝基苯肼125μl，漩涡混匀器充分混匀，置入 37℃水浴中15分钟；
87.4、向各管中加入0.4mol/l的naoh溶液1.25ml，漩涡混匀器充分混匀，室温放置3分钟，440nm，1cm光径，双蒸水调零测定各管吸光度值；
88.5、计算各管ldh活性(ui/l)。
89.如图5a所示，心肌缺血再灌注损伤发生后，缺血再灌注组ldh显著升高。注射纳米仿生药物(pda@raw)后，ldh降低，提示心肌梗死有所缓解。
90.b.酶联免疫吸附法(elisa)检测血清ckmb步骤如下：
91.1、标准品的稀释，配置浓度梯度；
92.2、加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl；
93.3、温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
94.4、洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5次，拍干；
95.5、加酶：每孔加入酶标试剂50μl，后7℃温育30分钟；
96.6、洗涤5次后显色：每孔先加入显色剂a50μl，再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
97.7、终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
98.8、测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)。根据标准曲线测定ck-mb值。
99.如图5b所示，心肌缺血再灌注损伤发生后，缺血再灌注组ck-mb显著升高。注射纳米仿生药物(pda@raw)后，ck-mb降低，提示心肌梗死有所缓解。
100.性能验证试验二、心梗后30天sd大鼠心肌组织切片天狼星红染色(标尺:100μm，纤维化染色为红色)。
101.天狼星红染色步骤如下：
102.1、心肌组织固定于10％福尔马林固定液，常规脱水包埋；
103.2、切片厚6μm，常规脱蜡至水；
104.3、天狼星红染色液滴染1h；
105.4、流水稍冲洗，去除切片表面染液；
106.5、mayer苏木素染色液染细胞核8～10min；
107.6、清洗10min后常规脱水透明，中性树胶封固；
108.7、显微镜拍照。
109.如图6所示，心肌缺血再灌注损伤发生30天后，缺血再灌注组纤维化面积显著升高，而注射纳米仿生药物(pda@raw)后，纤维化程度明显缓解。