质粒构建 | 从入门到精通

作者：张馨予

质粒构建的原理

外源 DNA 经 PCR 扩增后，用限制性内切酶分别切割载体和外源 DNA 片段，DNA 连接酶将二者进行连接，然后转入宿主细菌，通过筛选鉴定获得重组克隆。经过一系列的操作，「快递员」质粒就完成了呈递目标片段的工作。

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质粒构建流程示意图

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质粒构建的步骤

「快递」目标片段的过程主要有三个步骤： ▼▼▼

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PCR 扩增

「快递」准备，首先要对目标片段进行扩增富集。PCR 即聚合酶链式反应，它是一种用于扩增复制特定 DNA 片段的常用分子生物学技术。PCR 的最大特点是能将微量的 DNA 大幅扩增，在克隆前获得大量的目标基因片段。 PCR 扩增

简要步骤：

利用引物设计软件如 Primer 5 或 NCBI Primer-BLAST 在线设计引物并合成后，配制 PCR 反应体系：将模板、引物、dNTP、酶、反应缓冲液和 ddH₂O 按比例加入，加好后轻微点离，放入 PCR 仪中扩增目的片段，扩增后通过琼脂糖凝胶检测目的片段大小是否正确。

Tips

▼ 扩增过程中的关键点 ▼

PCR 扩增中随着拷贝数的增加经常会出现二聚体、非特异性条带（大小不对）的现象。

答案

A：通过降低模板和引物浓度、降低镁离子浓度、适当减少酶量，提高退火温度，可以提高扩增特异性。此外引物设计的好坏是关键。除了按照常规引物设计规则外，构建载体时通常会在引物序列上添加酶切位点和保护碱基。

常规引物设计原则

引物长度：18-30bp，常用 20-22bp 左右。

引物 Tm 值最好在 60℃ 左右，两条引物间 Tm 值要保持接近，最好不超过 5°C。

GC 含量 40%-60%，45-55% 为佳。

引物自身不应有连续 4 个及以上碱基的互补，避免形成发卡结构。

引物之间不应有连续 4 个及以上碱基的互补，避免形成引物二聚体。

3' 端避免连续碱基的重复，如 GGG 或 CCC 会导致错配的发生。

3' 端最后一个碱基最好是 G 或 C。

可使用 NCBI primer-blast 比对引物特异性。

一般在引物的 5′ 端添加酶切位点时（不影响扩增的特异性），根据酶切位点序列，需要添加不同种类和数量的保护碱基，多加 3 个碱基可以满足几乎所有限制性酶切要求，如常用 BamHI（CGCGGATCCGCG）,其保护碱基为蓝色部分。上下游引物最好加入不同的酶切位点，避免片段在连接过程中倒置，影响基因序列的正常表达。

扩增的片段拖尾严重，产物在凝胶上出现弥散状态。

答案

A：原因可能在于模板不纯、反应体系中各成分比例不合适、退火温度设置偏低、循环次数过多等。注意操作轻柔，PCR 扩增体系各组分严格参照说明书加入。

片段太长难扩增、发生错配概率大、测序出现点突变？

答案

A：扩增中设置适宜的退火温度（60℃ 左右），循环次数（30 次左右）不要太多，酶量要适中。传统 Taq 酶便宜高效，但扩增长度有限，出错率高。针对少量模板、复杂模板、长片段、稳定性差模板、高 GC 含量模板的扩增，选取具有高扩增能力、高保真、可靠性强的聚合酶是解决问题的重要一环。

酶切酶连

获得目标片段后，要交到「快递员」手中，必须借助两个工具来实现——酶切工具（限制性内切酶）和连接工具（DNA 连接酶）。 酶切酶连

简要步骤：

配制琼脂糖凝胶（常用浓度 1-2%）后点样，切胶电泳回收目的片段，选择合适的内切酶将目的片段和质粒载体同时切割，酶切后的片段再次电泳回收，测定浓度后按比例加入 T4 DNA 连接酶，粘性末端载体、目的片段、缓冲液，进行连接后直接转化。

Tips

▼ 酶切酶连技术关键点 ▼