高通量原位DNA合成将国产化，国外标杆三年涨1

作者：杨超月

DNA是遗传信息的主要载体,是生命奥秘的根本。而DNA合成则是人类探索生命奥秘过程中的必要工具。传统的柱式DNA合成技术能够适应一些小规模的科研场景。但如果深入到基因组层面,即使是最小的病毒基因组,也有几十Kb的长度,常见模式微生物大肠杆菌的基因组更有约4.2Mb的大小。如果使用传统的柱式DNA合成法来制备,这些最简单的基因组的制备成本就动辄数百万元。

应对于更复杂的DNA合成需求,高通量原位DNA合成技术逐渐进入人们的视野。DNA合成技术的高通量化正如电子计算机当年经历的小型化过程。如果没有光刻机和大规模集成电路制造技术,电子计算机可能今天仍然深藏于象牙塔中,无法在各领域发挥关键性作用。

那么,能够推动生命奥秘探索的“高通量原位DNA合成技术”究竟是怎样的呢?这一产业又将如何实现国产化?本文梳理了DNA合成技术的发展过程,并对产业的未来发展进行了预判。

DNA的生物合成和化学合成

生物体内的DNA合成是通过DNA聚合酶进行的,DNA聚合酶可以合成与模板链完全互补的DNA链。DNA生物合成的优点是速度快、条件温和、错误率低,人们利用这个原理发展了PCR技术,可以快速廉价的得到DNA链。但DNA生物合成依赖模板链,只能从已有的生物基因组中获取模板,合成互补的DNA链,却无法在没有模板的情况下,从头合成全新的DNA链,因此不能满足合成生物学和DNA存储的需求。

化学合成法曾在很长一段时间中成为直接合成DNA的主要方法。DNA化学合成基于固相化学合成的原理。固相化学合成的思路最早应用于多肽合成,性能突出,后续也广泛用于核苷酸和多糖的合成。发明人Merryfield因这一技术获得了1984年诺贝尔奖。

DNA化学合成由多个反应循环组成,单个循环主要包括脱保护、偶联、加帽、氧化四个步骤,循环地将合成载体上被保护的DNA链末端脱去保护,连接一个新的被保护的核苷酸单体,DNA链长加一。合成过程中多余的原料和杂质留在溶液中,而产物则保留在固相的载体上,因而不需要每步反应都进行纯化,特别适合长链生物大分子的自动化合成。DNA化学合成不需要模板,可以按需合成DNA链,但由于有机合成反应并不完全,如每循环合成效率为99%,则合成长度为100的DNA链,最终产物的得率只有0.99^100,即36.6%,因此DNA化学合成得到的链长往往小于生物合成。

高通量原位DNA合成将国产化，国外标杆三年涨1

图1:DNA固相化学合成(亚磷酰胺法)原理(图片源自网络)

利用DNA固相化学合成技术,可以在每个反应器上合成一条DNA,但由于化学合成的效率没有生物合成那么高,得到的DNA链长度通常不能超过200碱基。目前业界基于固相合成原理的柱式DNA合成仪(图2),通过柱式反应器进行DNA合成,借助工业自动化技术,可以同时控制192或者最多1536个反应器进行同时合成,即192或者最多1536条DNA链的合成通量。但限于反应器的尺寸,合成通量实际上已经达到了极限。如果仅用这个技术来进行大基因组合成,仍然如同步行环游世界一样困难重重。因此,DNA固相化学合成与合成基因组之间巨大的技术鸿沟,还需要用巧妙的方法来填平。

高通量原位DNA合成将国产化，国外标杆三年涨1

图2 柱式DNA合成仪。常见的有96*2=192通量,可控制192个柱式反应器合成。但由于反应器物理尺寸有限制,384*4=1536实际已经是这类仪器的通量极限。(图片源自网络)

高通量的“控制开关”

半导体行业中曾经遇到过类似的瓶颈。1938年人们发明了晶体管,并在1950年前后掌握了PN结的工作原理。一个晶体管就如同一条化学合成的DNA短链,不能发挥很大的作用,而利用光刻机、掩模板和光刻胶,人们可以在硅片的不同区域刻画出不同的图形,使得一些区域被暴露参加化学反应,另一些区域被光刻胶等保护起来不参加化学反应,通过这样的高通量“控制开关”,就可以在硅片的不同区域分别加工出微小的PN结、导线、电阻、电容等,最终制造出功能强大的CPU等芯片。信息产业摩尔定律式的飞速发展,证明了高密度集成芯片能极大降低电路成本和极大提高集成度。光刻机和芯片对信息产业的发展起到了飞跃性的提升效果。

因此,基于同样的思路,只要把大量的DNA化学合成位点集中在一个表面上,再设计合适的开关机制,自动控制表面上成千上万个合成位点的打开和关闭,使得反应按需地在特定区域进行,就可以制造出真正意义上的高通量DNA合成芯片。高通量DNA合成芯片在芯片大小的表面上可以同时进行数以万计甚至更多的DNA合成,合成成本比常规合成降低了几个数量级。尽管得到的每种DNA产物也比常规合成也降低了几个数量级,但在获得初始产物后,接下来就可以利用廉价高效的PCR技术对初始产物进行大量复制,大幅降低扩增成本。因此利用高通量DNA合成技术,实际可以把DNA从头合成的成本降低几个数量级。