技术|单克隆抗体制备方法的前世今生

作者：张馨予

1975年Köhler和Milstein提出的杂交瘤技术（Hybridoma technology），使得大量获得单克隆抗体成为可能，为基础研究及其临床应用提供了无限潜力。其他科学和技术进步也促进了单克隆抗体的发展、丰富了单克隆抗体的制备方法。经过近50年的发展，单克隆抗体制备方法不再局限于免疫小鼠的淋巴细胞术，噬菌体展示技术（Phage display）、人源抗体转基因小鼠（Human antibody-producing mice）和单B细胞抗体技术（Single B cell antibody technology）也都陆续登上舞台。这些方法虽然有各自的局限性，但都已广泛应用于单克隆抗体筛选。同时，这些技术都不完全是独立存在的，如果能充分利用各技术的优点，采用灵活的方法将各技术优化组合就能更加高效、快速地进行抗体开发。

杂交瘤技术

杂交瘤技术是一种将B细胞与骨髓瘤细胞融合生产小鼠单克隆抗体的传统方法，是目前应用最广泛的单克隆生产技术。在这种技术中，首先收集免疫小鼠的B淋巴细胞，并将其与BALB/c小鼠骨髓瘤细胞融合，从而形成永生化的杂交瘤细胞。然后筛选杂交瘤细胞，鉴定出能生产特异性抗体的单克隆细胞株。十几年后，1988年，兔单克隆抗体制备方法首次被《Science》杂志报道 [1]。该研究使用小鼠-兔异种杂交瘤方法生产兔单克隆抗体，但鼠-兔异种杂交瘤细胞分泌抗体的效率较低、不稳定，且无法长时间分泌抗体。时间进展到90年代中期，1995年，《PNAS》报道了能稳定生产兔单抗的兔-兔杂交瘤细胞 [2]。但兔杂交瘤细胞也被证明不如常规鼠杂交瘤细胞稳定，这大大阻碍了其实验室水平的广泛使用。并且，由于融合和转化效率低下，使用兔杂交瘤细胞生产单克隆抗体在应用推广中受到了极大的限制。

经过多年发展及应用，杂交瘤技术作为一种成熟的产生鼠单克隆抗体的方法已被广泛应用于多种抗体的生产。然而，由于缺乏合适的骨髓瘤融合伴侣，杂交瘤技术一直局限于免疫啮齿动物。20世纪80年代，《PNAS》报道了一种应用人杂交瘤技术生产治疗用抗体的文章 [3]。利用该方法可以在无额外修饰的情况下产生天然的人源抗体，并用于临床治疗。随着融合伴侣和电融合技术的发展，人杂交瘤细胞融合成功率逐步增加，这将在未来促进治疗性抗体的开发。

噬菌体展示技术

1990年开始，噬菌体展示技术被视为一种新的产生单克隆抗体的方法。这种方法是从淋巴细胞中收获抗体可变区基因（V gene）全集，克隆VHs和VLs的组合并与外壳蛋白融合后表达于丝状噬菌体表面，然后筛选表达特异性抗体的噬菌体。与受限于啮齿动物的杂交瘤技术相比，噬菌体展示技术已经成功用于任何已知免疫球蛋白基因的物种中筛选和分离单克隆抗体[4,5]。2000年，Rader等人首次介绍了应用噬菌体展示技术生产兔单克隆抗体的全过程[6]。在这篇文章中，Rader等人用噬菌体展示技术筛选和人源化的人A33兔抗体，不仅对人A33抗原有高特异性，且保留高亲和力。目前，噬菌体展示技术因为其高效、简便及体外控制在原核或真核系统中原则参数的能力正逐步成为生产治疗用抗体的重要技术平台。

随着我们对抗体结构、功能和序列多样性研究的不断深入，除了原有的抗体库外，一种新的合成抗体库技术也在不断发展。例如，HuCAL&Ylanthia文库中，为了使筛选出的人源抗体能更好的进行分子识别，将精确设计的序列插入抗原结合位点，并优化设计多种可变重链、轻链框架区域 [7-10]。随着文库设计和筛选方法的不断进步，合成抗体文库将成为快速生产具有高特异性和高亲和力单克隆抗体不可或缺的工具。

人源抗体转基因小鼠

1985年，Alt等人首次提出将人抗体基因引入小鼠种系并使用转基因小鼠中产生人抗体的想法 [11,12]。随着基因编辑技术的进步，使用人源抗体转基因小鼠生产人源化抗体已不再是天方夜谭。与其他技术相比，使用人源抗体转基因小鼠有许多优势，如无需人源化、具有更多的生物多样性，且由于体内成熟具有天然的亲和力。但是，人免疫球蛋白体量庞大对转基因小鼠抗体生产是一个巨大的挑战。为了克服这些困难，研究人员们通过使用不同策略已成功地获得转基因动物表达的人源抗体库，如全人源抗体小鼠和嵌合人源抗体小鼠等。

杂交瘤技术

单B细胞抗体技术