【收藏】CRISPR/Cas 植物基因组编辑技术

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

01 CRISPR/Cas 免疫系统的作用机制和分类

科学家们对CRISPR/Cas免疫系统的研究早在30 年前就已经就开始。1987 年，日本研究团队在研究大肠埃希菌 Escherichia coli 碱性磷酸酶的同工酶基因 iap 的时候发现，在该基因的 3＇端存在特殊的侧翼结构，即 29 bp 的高度相似序列分别被 32 bp序列间隔，形成了 5 个拷贝的串联重复序列[3]。但该团队并未对此现象进行更深入的研究。Mojica等[4-5] 对此产生了浓厚的兴趣，他们利用生物信息学检索探究，在 20 多种微生物中都发现了类似的短序列重复结构，并将这种短序列重复结构命名为规则的短间隔重复(Shortregularly spaced repeats，SRSRs)；提出 SRSRs 可能存在于原核生物基因组，包括所有嗜热细菌和古细菌中以及部分的蓝藻和变形菌门生物；总结了SRSRs的基本特征：24~40 bp 的短回文序列 (回文区可达 11 bp) 成簇存在，并被非重复的 20~58 bp 序列间隔开来。2002 年，为了更贴切地表示 SRSRs 的特征以及避免命名的混乱，Jansen 与 Mojica 商定将 SRSRs 更名为成簇有规律的间隔短回文重复序列 (Clusteredregularlyinterspaced short palindromic repeats，CRISPR)。Jansen 等[6] 发现大部分种类的原核生物具有 2 个或 2 个以上的 CRISPR 基因座前导序列，而这些CRISPR 基因座前端共享一个 300~500 bp 的种间保守前导序列，并通过比较 CRISPR 基因座侧翼的基因组信息，鉴定出不同原核生物中高度相似的4 个 CRISPR 关联基因：Cas1~Cas4。2005 年，Mojica等[7] 再次发表了对 CRISPR/Cas 系统研究的最新结果，他发现 CRISPR 中的间隔序列大部分来自噬菌体或接合质粒，并且携带某一噬菌体片段的细菌具有对相应噬菌体的抵抗力；CRISPR 基因座存储了病原菌的基因信息，可能是微生物适应性免疫系统的一部分。随后，另有2个科研团队也发表了相近结果的论文[8-9]。2007 年，Barrangou 等[10] 证明了在噬菌体攻击后，筛选到的抗性细菌的 CRISPR 区整合了新的间隔序列，而间隔序列正是来源于噬菌体DNA，也就是说，细菌通过识别与噬菌体序列相同的 CRISPR 间隔区对应的特定序列，获得对噬菌体的抗性，产生适应性免疫能力；还确认了CRISPR关联基因 Cas7 帮助细菌获得新的间隔序列和重复，Cas9 则发挥了核酸切割酶的作用，为细菌免疫系统所必需。随后的几年，CRISPR 细菌免疫系统的必要条件和作用机制相继被发现和证实，如CRISPR 中依靠重复序列形成的 crRNA 是 CRISPR产生抵抗力的关键[11]，Cas9 切割的对象是 DNA[12]，且对 DNA 的精准切割的位点与 crRNA 特定序列和 PAM(Proto-spaceradjacent motif) 序列有关[13-14]，Ⅱ型系统中 tracrRNA 也参与了 Cas9 的切割[15] 等等。

CRISPR/Cas 系统广泛分布于 90% 的古细菌及 50% 的细菌基因组或质粒上[16]。它由 CRISPR基因座和 Cas 基因 2 部分组成，其中，CRISPR 基因座又包括位于 CRISPR 基因座上游富含 AT 碱基的前导序列 (Leader)、涵盖回文序列的 20~50 bp 的重复序列 (Repeat) 和从外源捕获的间隔序列 (Spacer)。CRISPR/Cas 系统的免疫过程分为 3 个阶段[17]：1) 外源 DNA 首次入侵时，细菌进入适应阶段，来源于噬菌体或质粒上的前间隔序列(Protospacer)的 DNA同源短片段被整合到 CRISPR 基因座前导序列下游中，形成新的间隔序列；2) 外源 DNA 再次入侵时，细菌激活了表达阶段，CRISPR 基因座转录出前体crRNA，由内切核糖核酸酶催化加工成成熟的crRNA；3) 在干扰阶段，成熟的 crRNA 引导 Cas 蛋白复合物靶向噬菌体前间隔序列位置，识别噬菌体基因组内的 PAM 序列，对外源靶标位置精准切割从而避免细菌切割自身 CRISPR 基因座。

2012 年，Jinek 等[15] 在《Science》上发表研究成果，证明了 crRNAs (CRISPR RNAs) 与 tracrRNA (Trans-activatingcrRNA，反式作用crRNA) 配对结合后形成双分子的RNA结构，可以介导 Cas9 蛋白定向切割 DNA 序列。2013 年，张峰团队率先利用CRISPR/Cas9 技术在人类和小鼠细胞内实现了精准的基因编辑，并构建了可同时靶向多个位点的基因编辑系统[18]。此后，CRISPR/Cas 基因编辑技术蓬勃发展。

Makarov 等[17, 19] 根据 Cas 基因的数目和功能将 CRISPR/Cas 系统分为了 2 大类 5 种类型 (Ⅰ ~Ⅴ)16 种亚型，其中，Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型属于第 1 类，它们在干扰靶基因时需要多个Cas 蛋白形成复合物协同工作；Ⅱ和Ⅴ型属于第2 类，它们利用单一Cas蛋白就能够干扰靶基因。第2 类Ⅱ型系统较为简单，研究也更加透彻，目前应用较广的 CRISPR/Cas9系统为Ⅱ 型CRISPR 系统，而新兴的 CRISPR/Cas12a(Cpf1) 系统属于Ⅴ 型CRISPR 系统。Shmakov 等[20]2015 年又发现了Ⅵ和Ⅴ型的 2 种亚型。

01 CRISPR 基因编辑系统的建立

在对细菌的CRISPR/Cas 免疫系统及作用机理有了较深的认识后，科学家们开始对该系统进行改造并应用于动植物的基因组编辑。目前应用最广泛的 CRISPR 基因编辑系统主要包括CRISPR/Cas9系统和 CRISPR/Cas12a 系统。

CRISPR/Cas9 系统的建立