【线上论坛】“代谢鸿论”第127讲精彩回顾

作者：张馨予

撰文 | 于昊南京大学甘振继课题组
中国生物物理学会代谢生物学分会主办的线上论坛“代谢鸿论”在第127讲非常荣幸地邀请到了来自美国华盛顿大学的Gerald W Dorn II教授进行题为“Understanding Mitochondrial Dys-Dynamism”的主题报告。下面，让我们一起来回顾本次论坛的精彩内容吧！主讲人简介
Gerald W. Dorn II博士是美国华盛顿大学医学院的 founding director of the Center for Pharmacogenomics 和 Philip and Sima K Needleman Professor。他目前的研究课题主要关注mitofusin蛋白的调控机制。利用包括遗传学及生理学操作的动物模型，用于阐明心脏奥秘的mini-mouse技术和人类遗传学/基因组学在内的手段，他的课题组发现PINK1激酶磷酸化MFN2，使其能够与Parkin结合，从而消除融合作用并促进线粒体自噬。这种“MFN2磷酸化开关”的重要性后来在线粒体自噬介导的围产期心脏代谢重塑中得到证实。此外，他的课题组还进一步发现了这一开关的生物物理机制，即MFN2磷酸化的构象改变影响了蛋白质配对，从而促进了心脏的代谢功能转变。这一范式促进了变构小分子形式的mitofusin激动剂的发展，并且现在这些激动剂正在进行针对于mitofusin功能受损疾病的临床前评估。当前，他的课题组还在继续探究mitofusin蛋白磷酸化及其他翻译后修饰的调控作用。
Dorn教授获得了多个奖项和荣誉，包括Established Investigator Award、the Distinguished Scientist Award from the American Heart Association 和 Harrington Scholar-Innovator Award。他曾担任Science, Circulation, and Circulation Research等期刊的编辑委员会成员。
论坛回顾
1、线粒体融合蛋白（Mitofusins）的定义与功能
线粒体融合蛋白2（Mitofusin 2，MFN2）是一种线粒体命运的节点调节蛋白，其功能由与之结合配对的不同蛋白而决定。在与线粒体融合蛋白1（Mitofusin 1，MFN1）蛋白结合后，并在显性视神经萎缩蛋白（Optic Atrophy 1，OPA1）的作用下，MFN2具有融合的作用，目的是修复线粒体；而在与Miro蛋白结合后，MFN2会表现出有运输性的功能，从而参与线粒体的物质运输；此外，MFN2的功能还可以由Pink1/Parkin通路决定，在与磷酸酶Parkin结合被磷酸化后，MFN2会参与线粒体的自噬，从而清除老化或者出现病理特征的线粒体。当MFN2的基因发生突变，会导致一种名为夏科-马里-图思病（Charcot-Marie-Tooth disease type 2A，CMT2A）的罕见病，其病理症状是出现视神经萎缩和多发对称性脂肪瘤病[1]。不仅如此，当MFN2的基因表达下调，会导致肌萎缩侧索硬化[2]（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）; MFN2的基因缺失，会导致化疗引起的外周神经病变[3]（Chemotherapy Induced Peripheral Neuropathy，CIPN）。
2、线粒体融合蛋白的运作方式
线粒体融合蛋白是调节线粒体的动力蛋白家族内的GTP酶，拥有两种不同的蛋白：MFN1和MFN2，他们存在于线粒体的外膜，当两个分离的线粒体发生融合时，这它们膜上的这两种蛋白相互接触，利用GTP断裂末端高能磷酸键变成GDP时释放的能量，将两个分离线粒体的外膜进行融合。待两个线粒体外膜完全融合后，OPA1蛋白会继续利用GTP断裂末端高能磷酸键的能量将两个线粒体各自的内膜融合，形成一个大的、完整的线粒体。
此外，MFN2还有一些非公认的功能[4]：
参与线粒体运输性：MFN2对于正常的线粒体运输来说是非常必要的，可能是因为通过利用MIRO蛋白与Milton/Trak的相互作用来完成运输的。
参与线粒体自噬：MFN2被PINK1激酶磷酸化后失去了促进融合的能力，但是获得了起始Parkin介导的线粒体自噬的能力。
可见，MFN2的磷酸化是一种蛋白质构象和功能的改变。在没有被磷酸化前，MFN2的MFN-MFN结合的构象是开放的，能够促进融合；但是在被PINK1激酶磷酸化后，Parkin-MFN结合位点的构象就会关闭，进而促进线粒体自噬[5][6]。
根据上述证据，Dorn教授提出了一个关于mitofusins模型，认为线粒体融合蛋白的结构就像是郁金香。他先描述了单个MFN2的结构，是由头部的GTP酶、中部的α螺旋核心和尾部的TM结构域组成。将MFN2的顺式同型二聚体比喻为郁金香的每一片花瓣，而将由MFN2顺式同型二聚体组成的MFN2顺式低聚体比喻为由9片花瓣组成的一朵完整的郁金香花。当两个线粒体接触并发生相互作用时，外膜上的MFN2蛋白结构域处于开放的构象，所以它们相接触时，各自的“花瓣”头部的GTP酶区域相结合，宛如两朵花“亲吻”，之后MFN2的结构域会再次关闭，并发生回缩。
3、在药理学方面模仿对MFN2的磷酸化和去磷酸化的效果
药理学方面利用多肽和小分子模拟肽对MFN2的“拉链结构域”的竞争性结合，表现出对变构线粒体融合蛋白激活作用。详细来说就是当MFN2的拉链结构域HR1和HR2相互结合时，MFN2的两条臂会像夹子一样紧紧贴在一起，此时MFN2处于关闭状态。但当嵌合体B-A/I或短肽MP-1结合到拉链结构域，MFN2就如同被打开的夹子，HR1和HR2不再结合，此时MFN2就处于开放的激活状态。根据这样的原理，设计出了两种药物，分别是trans-MiM111和CPR1B。trans-MiM111有强力的激活效果[7]，CPR1B有可以持续激活的作用[8]。
此外线粒体融合蛋白激活与神经治疗机制的串联使用，既可以通过推动线粒体融合干扰线粒体损坏的反馈循环来抵抗细胞的损伤。也可以通过推动运输性来运输健康的线粒体前往轴突的生长芽加速神经的修复/再生。
MFN2功能缺失导致CMT2A相关的神经退化。常染色体显性MFN2突变，从儿童早期(约4岁)开始缓慢进展，20岁前因上肢和下肢神经原性肌肉萎缩而永久残疾，但是不影响正常预期寿命。这是一种不能完全治愈的疾病，只能通过使用夹板、轮椅或者PT/OT治疗来缓解病情。
4、激活线粒体融合蛋白在CMT2A病人和CMT2A小鼠模型神经元中的研究
对成纤维细胞直接的重编程使CMT2A患者出现运动神经元。线粒体融合蛋白的激活纠正了CMT2A病人成肌细胞和神经元中不正常的线粒体[9]。
此外还建立了一种包含CMT2A重要特征的小鼠模型，在这种小鼠模型中激活线粒体融合蛋白（每天给药trans-MiM111一次）逆转了鼠科动物的CMT2A病理特征，神经肌肉功能和神经肌肉电生理完整性都有提高。此外，激活线粒体融合蛋白使坐骨神经的线粒体运动性正常化、使坐骨神经的轴突直径和畸形的线粒体正常化、恢复了体内突触数目和线粒体的驻留、在体外加速了CMT2A神经元的再生为[10]。不仅如此将线粒体融合蛋白激动剂的神经学适应症扩展到CMT2A以外，发现激活线粒体融合蛋白对ALS等疾病也有一定治疗效果。
5、线粒体融合蛋白在心脏健康中的作用
利用小鼠KO和TG模型都表明线粒体融合蛋白在心脏健康中也有作用[11][12]。但是心脏并没有卷入MFN2突变引起的疾病。Dorn教授分析了其中的原因：
（1）心脏需要线粒体来源的ATP
（2）心肌病是由线粒体基因组突变引起的综合征
（3）心肌细胞靶向敲除MFN2可引起小鼠心肌病
（4）但是，心肌病在人类周围神经疾病变中未见，视神经萎缩脂肪营养不良由MFN2天然突变引起
所以，Dorn教授想知道了破坏性的MFN2突变是否可以调节心脏疾病。
根据Dorn教授先前的工作，他们找到了两种影响视网膜和心脏功能的MFN2突变：MFN2 M393I和MFN2 R400Q。然后他们进行了罕见MFN2突变体的遗传筛选，从而鉴定出MFN2 R400Q在心肌病中有重要作用。后续一系列实验证明，MFN2Q/Q400 KI鼠会在胚胎期会有早期的致死性，因为MFN2 Q/Q400小鼠患有不完全穿透性围产期心肌病.此外MFN2 Q/Q400心肌病显示出线粒体自噬缺陷导致代谢不匹配的mRNA样式[13]。
所以Dorn教授和他的团队推测线粒体自噬性心肌病很可能是一种新型心肌疾病，他们也找到了一些证据来支持此推论：
（1）MFN2R400Q在成人心肌病中过度表达约20倍。
（2）MFN2 Q400具有前所未有的功能：线粒体融合和线粒体自噬功能缺陷，但线粒体运输能力正常。
（3）MFN2 Q400有一种新的功能障碍机制：构象变化受损，但是可以通过变构线粒体融合蛋白激活剂纠正。
（4）MFN2 Q/Q400敲入小鼠在胎儿晚期或出生后会立刻发生心肌病，但没有其他器官涉及其中。
最后Dorn博士认为MFN2相关的心肌疾病的形成与MFN2介导的线粒体自噬和线粒体融合失调相关，而MFN2相关的神经退行性疾病与MFN2介导的线粒体融合和线粒体运输功能失调有关。
参考文献
[1] Züchner, Stephan et al. “Mutations in the mitochondrial GTPase mitofusin 2 cause Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A.” Nature genetics vol. 36,5 (2004): 449-51.
[2] Wang, Luwen et al. “Mitofusin 2 Regulates Axonal Transport of Calpastatin to Prevent Neuromuscular Synaptic Elimination in Skeletal Muscles.” Cell metabolism vol. 28,3 (2018): 400-414.e8.
[3] Bobylev, Ilja et al. “Depletion of Mitofusin-2 Causes Mitochondrial Damage in Cisplatin-Induced Neuropathy.” Molecular neurobiology vol. 55,2 (2018): 1227-1235.
[4] Dorn, Gerald W 2nd. “Evolving Concepts of Mitochondrial Dynamics.” Annual review of physiology vol. 81 (2019): 1-17.
[5] Franco, Antonietta et al. “Correcting mitochondrial fusion by manipulating mitofusin conformations.” Nature vol. 540,7631 (2016): 74-79.
[6] Rocha, Agostinho G et al. “MFN2 agonists reverse mitochondrial defects in preclinical models of Charcot-Marie-Tooth disease type 2A.” Science (New York, N.Y.) vol. 360,6386 (2018): 336-341.
[7] Dang, Xiawei et al. “Discovery of 6-Phenylhexanamide Derivatives as Potent Stereoselective Mitofusin Activators for the Treatment of Mitochondrial Diseases.” Journal of medicinal chemistry vol. 63,13 (2020): 7033-7051.
[8] Dang, Xiawei et al. “Pharmacophore-Based Design of Phenyl-[hydroxycyclohexyl] Cycloalkyl-Carboxamide Mitofusin Activators with Improved Neuronal Activity.” Journal of medicinal chemistry vol. 64,17 (2021): 12506-12524.
[9] Dorn, Gerald W 2nd, and Xiawei Dang. “Predicting Mitochondrial Dynamic Behavior in Genetically Defined Neurodegenerative Diseases.” Cells vol. 11,6 1049. 19 Mar. 2022, doi:10.3390/cells11061049
[10] Franco, Antonietta et al. “Burst mitofusin activation reverses neuromuscular dysfunction in murine CMT2A.” eLife vol. 9 e61119. 19 Oct. 2020, doi:10.7554/eLife.61119
[11] Song, Moshi, and Gerald W Dorn 2nd. “Mitoconfusion: noncanonical functioning of dynamism factors in static mitochondria of the heart.” Cell metabolism vol. 21,2 (2015): 195-205.
[12] Song, Moshi et al. “Abrogating Mitochondrial Dynamics in Mouse Hearts Accelerates Mitochondrial Senescence.” Cell metabolism vol. 26,6 (2017): 872-883.e5.
[13] Eschenbacher, William H et al. “Two rare human mitofusin 2 mutations alter mitochondrial dynamics and induce retinal and cardiac pathology in Drosophila.” PloS one vol. 7,9 (2012): e44296.
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原标题：《【线上论坛】“代谢鸿论”第127讲精彩回顾》