19 S蛋白与人ACE2蛋白表面糖链和独特翻译后修饰的

作者：杨超月

本文选自中国工程院院刊《Engineering》2021年第10期，原文出自：Mass Spectrometry Analysis of Newly Emerging Coronavirus HCoV-19 Spike Protein and Human ACE2 Reveals Camouflaging Glycans and Unique Post-Translational Modifications

引言

当下新冠病毒肺炎（COVID-19）的国际大流行促使全球科学家努力尝试揭秘新冠病毒HCoV-19的生物学特性。浙江大学李兰娟院士团队通过质谱分析（MS）发现，在HCoV-19 S蛋白的21个潜在糖基化修饰位点中，有20个位点完全被N-糖链占据，其糖型以低聚甘露糖为主。人血管紧张素转换酶2（hACE2）的7个糖基化位点完全被复合型N-糖链占据。然而，糖基化修饰并不能直接影响HCoV-19 S蛋白与hACE2之间的结合亲和力。另外，他们还发现了S蛋白和hACE2的多个甲基化修饰位点，以及hACE2的多个羟脯氨酸修饰位点。通过在最近发表的冷冻电镜（cryo-EM）结构的基础上加入N-糖链和蛋白质翻译后修饰（PTM），他们构建了HCoV19 S蛋白和hACE2的精细结构模型。本研究揭示的HCoV-19 S蛋白和hACE2的PTM及糖基化图谱为研究病毒的宿主黏附、免疫反应，以及相关药物和疫苗的研发提供了更多的蛋白质结构细节。

2019年12月暴发的新冠病毒肺炎（COVID-19）已成为全球卫生领域的重大事件。该疾病是由一种新发现的β-冠状病毒HCoV-19（也称为SARS-CoV-2）引起的。该病毒与严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）密切相关。与SARS病毒一样，HCoV-19病毒会引起下呼吸道感染（LRTI），最终可能发展为需要重症监护和机械通气的非典型肺炎。与SARS-CoV相比，HCoV-19具有更强的传染性，在全球范围内会有更多的感染人群，因此死亡人数更多。虽然研究表明HCoV-19可能存在包括蝙蝠和穿山甲在内的多个中间宿主，但仍需更多的研究来阐明其确切的病毒来源和传播途径。

SARS-CoV冠状病毒的棘突蛋白含有23个N-连接的糖基化序列(N-X-S/T, X≠P)。与其类似，HCoV-19棘突蛋白预计每个单体包含22个糖基化序列，也即每个三聚体含66个糖基化序列。然而，HCoV-19 S蛋白的S1区的糖基化位点与SARS-CoV有所不同，而S2区的糖基化位点则明显保守。这种S1糖基化模式的差异可能与HCoV-19以及其他冠状病毒的生物学和临床特征的差异相关。

因此，在本研究中，浙江大学李兰娟院士团队报道了HCoV-19 S蛋白和hACE2的N-糖基化及其他种类的翻译后修饰（PTM）的高分辨率质谱分析（MS）结果，并在此基础上重新描绘了目前HCoV-19 S蛋白的最新空间结构模型，以突出与COVID-19发病机制相关的重要糖基化特征。但是，研究证明，HCoV-19 S蛋白与hACE2的结合与糖基化状态无关（图1）。

图1. HCoV-19棘突蛋白和人hACE2潜在的糖基化位点。（a）利用15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对糖基化与去糖基化的HCoV-19棘突蛋白及hACE2进行分析，左侧为分子量标记。（b）HCoV-19棘突蛋白（上图）及hACE2（下图）的功能域示意图。CD：连接区；CH：中心螺旋区；CT：细胞质尾部区；FP：融合肽；TM：穿膜区；UH：上游螺旋区；HR1/2：七肽重复区1/2。蓝色区域为可能的HCoV-19棘突蛋白与hACE2的结合区域。每个区域中可能的糖基化位点均已标出。红色标出的是本研究中证实存在糖基化的位点。HCoV-19棘突蛋白N331和N343位点（c）以及hACE2的N90位点（d）的去糖基化质谱图。

研究还表明，除N17位点外，HCoV-19 S蛋白的所有位点都被糖基化高度修饰。根据S蛋白的N-糖链模型，蛋白质表面有很大一部分面积被糖链覆盖，这与以前报道的各种S蛋白一致。当比较HCoV-19和SARS-CoV的S蛋白时，研究人员注意到糖基化位点的大部分差异发生在S1亚单位的远端，因此导致由棘突三聚体形成的病毒最外层的糖链谱有显著差异。糖基化的差异可能是宿主或环境压力选择的结果，并可能暗示该病毒在感染性、发病机制和宿主反应方面的特性。在本研究进行过程中，研究人员也注意到，其他几个研究小组也在试图破解HCoV-19 S蛋白的糖链谱。所有这些研究都证实了HCoV-19 S蛋白是高度糖基化的。

除糖基化外，浙江大学李兰娟院士团队还研究了其他翻译后修饰类型。甲基化修饰在S蛋白和hACE2的多个位点都被鉴定。尤其是hACE2与S蛋白的受体结合结构域（RBD）结合位点周围的57E、68K和329E位点被完全甲基化。甲基化会导致电荷损失，从而增加这些位点的疏水性。在hACE2的蛋白酶结构域中鉴定出4种羟脯氨酸修饰位点（即253、263、321和346位点）。额外的羟基可能会增加脯氨酸在hACE2细胞外区域的亲水性。未来还需要进一步研究以揭示这些PTM可能的生物学作用。在研究人员的数据集中没有发现磷酸化和乙酰化修饰，这和先前对SARS-CoV的PTM研究相一致。脂肪酸酰化在本研究中也被考虑，因为它们通常存在于表面病毒蛋白中，可以促进膜融合和病毒入侵。然而，本研究并没有发现HCoV-19 S蛋白中存在酰化修饰的证据。考虑到多种蛋白酶处理的蛋白质组学实验几乎可以实现对这两种蛋白质的全覆盖，研究人员认为HCoV-19 S蛋白和hACE2的翻译后修饰组学主要由糖基化、甲基化和脯氨酸氧化组成。

关键词：N-糖基化；新冠病毒肺炎（COVID-19）；棘突蛋白；hACE2；蛋白结构

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