5.Western Blot

作者：王韵壹、李英、熊慧卿

Western Blot（蛋白质印迹法）

实验概述：

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，简称WB。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

实验目的：

获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。

实验原理：

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

实验步骤：

1. 提取组织或细胞蛋白

1) 提取组织蛋白流程

a) 将PBS置于冰上预冷。

b) 从-80℃冰箱中取出保存的组织放于冰上，用剪刀剪取绿豆粒大小的组织（30mg左右），放入标记好的1.5mlEP管中。

c) 向装有组织的EP管中加入预冷的1X的PBS液体400μl，用剪刀剪碎组织，用小离心机短暂离心，弃上清。

d) 重复步骤3两遍。

e) 在研钵中加入400μl裂解液（1片磷酸酶抑制剂溶解于10ml RIPA，再加入100μl100mM的PMSF），将EP管中的组织转移到研钵中。

f) 加入少量液氮充分研钵组织至匀浆状态。

g) 将匀浆小心转移至1.5mlEP管中，冰上放置20min。

h) 预冷离心机。离心：4℃，12G，20min。

i) 离心后的EP管中的液体分为3层，吸取中间层（目的蛋白）。

2) 提取细胞蛋白流程

a) 对于悬浮细胞，收集对数生长期细胞，消化为单细胞，离心后弃上清液，用4℃预冷的PBS离心洗涤2~3遍，弃上清后将装有细胞的离心管置于冰上；对于贴壁细胞，可将细胞消化下来按照悬浮细胞的操作（也可用预冷的PBS洗涤后（防止培养基中的蛋白干扰），直接加入裂解液后再冰上摇床30min后用细胞刮刀将细胞刮下来）。

b) 加入裂解液（10cm皿加1ml裂解液，六孔板一孔加200μl裂解液），混匀后转移至1.5mlEP管中，并置于冰上裂解30min。

c) 离心机提前预冷，裂解结束，涡旋一下后离心（4℃，12G，15min）。

d) 离心结束后取上清液定量检测蛋白浓度，用PBS稀释到蛋白浓度一致（验证敲减效率、过表达等需要equal loading的实验建议测蛋白浓度），加入5X loading buffer（裂解液：5X loading buffer=4：1），100℃煮样10-20分钟，注意用试管架压防止爆盖子（使蛋白加热变性带上负电荷）。