NGS文库构建的关键酶！

作者：张馨予

高通量测序又称下一代测序技术(Next-generation Sequencing, NGS)，相对于第一代DNA测序技术（Sanger法），它可以同时对几十万乃至数百万条核酸分子序列进行测定，具有通量高、成本低、规模大等显著优势，应用范围非常广泛，目前已经成为全球主流测序技术。

NGS测序流程主要分为 样本制备、文库构建、上机测序、数据分析 四个流程，在上述涉及的相关实验过程中，酶在其中起着至关重要的作用，这里针对性的对文库构建中的关键酶进行介绍。

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图1. NGS测序流程图(Gulilat, M. et al. 2019, BMC Medical Genomics)

文库构建的本质是将片段化后的基因组DNA两端加上通用接头序列，通过PCR扩增获取足够多能够上机测序的文库核酸分子。根据样本类型，又分为DNA建库和RNA建库。在DNA文库构建过程中，TA克隆连接接头建库是目前商业技术中最常用的技术手段，主要建库流程如下：

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图2. Illumina 平台DNA文库构建流程

DNA片段化

由于目前市场中测序仪的测序长度通常在 150-500bp 之间，因此需要使用机械打断或酶切打断的方法将大片段基因组DNA片段化为小片段的DNA。机械打断的方式对样本的损耗相对较高，操作方式也更为复杂，市面上也常用酶切的方式对基因组DNA进行打断。与机械法相比，酶切法的成本更低，操作更简便，加入片段化酶后仅需反应一段时间即可。目前常用的片段化酶主要有两种，一种是基于转座子原理的Tn5转座酶，另一种是核酸内切酶的混合酶，但是这些片段化酶的效果容易被样本GC含量、碱基偏好性所影响。与此相比，翌圣研发的片段化酶(Yeasen Cat#12917)酶切效果稳定，偏好性远低于Tn5转座酶，针对不同的DNA类型样本（包括FFPE样本）都有优异的测序结果。

末端修复，3'端加“A”：

打断后的DNA会产生5'/3'黏性末端以及平末端，而所有的黏性末端都需要转为平末端，包括3'突出末端切平、5'突出末端补平。在使用TA连接的方式进行接头连接时，DNA片段还需要5'端磷酸化和在3'端加“A”，才能与带“T”黏性末端的接头互补配对。以上过程由T4 DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、Taq DNA聚合酶协作完成。 T4 DNA聚合酶(Yeasen Cat#12901)具有5'→3'DNA聚合酶活性，可沿 5'→3'方向催化合成 DNA，补平5'突出末端；同时该酶也具有3'→5'外切酶活性，能够用于3'突出末端的切平，从而将含黏性末端的DNA片段转变为平末端DNA。由于人工合成的PCR引物、接头等5'端通常都是羟基基团而不是磷酸基团，因此需要T4多聚核苷酸激酶(Yeasen Cat#12902)在ATP 存在时催化ATP的γ-磷酸基团转移到寡核苷酸链的5'端羟基末端上，为下一步连接接头做准备。 Taq DNA聚合酶(Yeasen Cat#13486)具有5'→3'聚合酶活性，可以从5'→3'方向合成DNA，同时它具有的脱氧核苷酸转移酶活性可以在PCR产物的3'末端添加一个核苷酸“A”。

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图3. 多种酶参与末端修复过程

接头连接：

接头是文库中的重要组成部分，测序中常用的Illumina平台Y型接头，包含 P5/P7、Index、以及Rd1/Rd2 SP序列 。其中，P5/P7序列用于和测序芯片上的序列进行配对，将待测片段固定在Flowcell上完成桥式扩增；Index用来区分上机测序混合文库中的不同样本，而Rd1/Rd2 SP是Read1和Read2测序引物结合区域。接头连接一般用T4 DNA连接酶(Yeasen Cat#10298)，它可以修复双链DNA上的单链切口，使两个相邻的核苷酸重新连接起来，在接头连接中可将带有“T”黏性末端的接头和带“A”黏性末端的DNA片段连接起来形成一个完整的双链。

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图4. Illumina 平台一般接头连接过程

PCR富集：

通过PCR反应获取到足够多带接头的DNA序列，上机完成对样本核酸序列的测序。PCR通常用的Canace 高保真DNA聚合酶(Yeasen Cat#13476)具有5'→3'聚合酶结活性，可沿 5'→3'方向合成 DNA；除此之外，还具有3'→5'外切酶的活性，能够在扩增过程中纠正错误掺入的碱基，从而快速、高保真的扩增DNA片段。 RNA文库的构建，根据RNA的种类可以分为 mRNA文库、LncRNA文库 等，其中常规RNA文库构建包括

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图5. Illumina平台mRNA文库构建

RNA富集：