科学网[转载]Fermentas 体外转录疑难问题解答指南

作者：张馨予

1. 低产量或无RNA转录子
1.1. 反应条件未优化。
常规体外转录反应时，1 μg模板经RNA聚合酶或T7 Transcription Kit (#K0411)介导可转录产生至少10 μg RNA转录子。如需获得更高产量的RNA转录子(多达200 μg)，推荐使用TranscriptAid? T7 High Yield Transcription Kit (#K0441)。每20 μl反应体系中加入0.02-0.1 u (0.2-1 μl) Pyrophosphatase, Inorganic (#EF0221)可降低焦磷酸抑制作用，增加RNA产量。
1.2. RNase污染。
工作环境、DNA模板、试剂或电泳系统都有可能污染RNases。
遵照RNA操作常规推荐。
使用无RNase污染的酶、核苷酸和DEPC-处理水(#R0601)。
使用RiboLock? RNase Inhibitor(#EO0381)保护合成的RNA免受RNases降解。
备注
RiboLock? RNase Inhibitor可抑制RNases A、B和C的活性。但是其不能抑制RNases I、T1、T2、H、U1、U2和CL3的活性。
不要使用曾经小量分析过质粒DNA的电泳装置，因为其可能污染有RNases A或T1。
1.3. 短片段转录子产量低。
增加模板用量和延长反应时间可提高短片段转录子(<100 bases)的产量。模板用量可增加到2 μg；反应时间也可延长到4-8小时。
1.4. DNA模板纯度或浓度低。

与对照模板协同作用，分析样本模板是否含有抑制反应的污染物。与对照模板相比，如果样本模板的转录产量非常低，建议更改转录反应条件(将实验模板和对照模板等量混合，DEPC-处理水(#R0601)调整反应体积)。
琼脂糖凝胶评价转录子：

图. 混合实验结果分析。
C – 对照模板
S – 样本模板
C/S1 – C和S混合物：对照反应受样本模板溶液抑制
C/S2 – C和S混合物：对照反应不受样本模板溶液抑制

如果对照反应受样本模板抑制(见图"混合实验结果分析" C/S1)，这表明：

1.5. 模板DNA溶液中存在反应抑制剂。
模板DNA可能含有残留的SDS、EDTA、蛋白、盐*和RNases。可用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀重新纯化模板。模板的A260/280比例通常在1.8-2.0之间。70%冰乙醇洗涤沉淀可除去DNA沉淀中的EDTA和盐。
* 当NaCl或KCl浓度超过150 mM时，T7和SP6 RNA聚合酶的活性~50%被抑制；当NaCl或 KCl浓度超过250 mM时，T3 RNA聚合酶的活性~50%被抑制。当反应体系中含有硫酸铵时，超过50%的聚合酶活性被抑制。

如果对照反应不受样本模板抑制(见图, C/S2)，而RNA产量却很低时，这表明：

1.6. 模板用量不够。
模板含量低会极大地降低RNA产量。DNA模板溶液中含有的RNA和染色体DNA会干扰UV吸光值，从而导致模板DNA浓度的错误测定。如需精确测定模板浓度、大小和完整性，需采用UV吸光值和凝胶电泳分析模板浓度。
1.7. 反应体系配制不正确。
当反应体系有亚精胺存在时，如果在冰上配制反应体系或者各组分加样顺序不正确都会导致DNA沉淀。水通常最先加入反应体系。
2. 转录子片段大小超过预期
2.1. 质粒DNA模板切割不完全。
即使是少量未切割的环状DNA也会产生大量长片段转录子。确保模板完全切割，如果有必要，选用适当的限制酶再次切割模板DNA。如需快速和高效切割质粒，请选择FastDigest?限制酶。如果不能完全切割，建议用DNA Extraction Kit(#K0513)凝胶纯化切割的模板。
2.2. DNA模板含有3’-突出末端。
避免选用产生3’-突出末端的限制酶切割质粒。转录前常用T4 DNA Polymerase (#EP0061)处理3’-突出末端使之平端化。
2.3. 转录子条带迁移异常。
由于二级结构，RNA可能在非变性凝胶上电泳异常。转录子在变性凝胶上的迁移类似于单链分子，其迁移速率由分子量大小决定。
3. 变性琼脂糖凝胶上转录子条带弥散
3.1. 模板DNA中有RNase污染。
纯化过程中，质粒DNA模板通常含有污染的RNase。RNase会影响RNA的合成产量和长度，电泳时在预期长度条带下端产生弥散条带。如果使用商业化试剂盒，如GeneJET? Plasmid Miniprep Kit(#K0502)纯化质粒，可省去RNase A处理和DEPC-处理水(#R0601)洗脱质粒的步骤。如果RNaseA预先与纯化缓冲液混合，质粒线性化后选用酚/氯仿抽提、乙醇沉淀DNA和DEPC-处理水(#R0601)溶解DNA。
3.2. 工作环境中存在RNase污染。
遵照RNA操作常规推荐(p.367)。
使用无RNase的酶、核苷酸和水。
使用RiboLock? RNase Inhibitor(#EO0381)保护合成的RNA免受RNases降解。
备注
RiboLock? RNase Inhibitor可抑制RNases A、B和C的活性。但是其不能抑制RNases I、T1、T2、H、U1、U2和CL3的活性。
不要使用曾经小量分析过质粒DNA的电泳装置，因为其可能污染有RNases A或T1。
4. 断裂的转录子
4.1. RNA聚合酶识别模板DNA序列中的终止信号。
改用另一种RNA聚合酶系统或者在低温(如30°C)条件下进行转录反应。这样会增加转录子长度，但是低温会降低转录子产量。
4.2. DNA模板富含GC(或模板的二级结构较多)。
如果模板具有二级结构，选择42°C反应或使用单链结合蛋白(SSB)。有报道表明单链结合蛋白(SSB)可增加转录子产量和长度(2)。

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