快速筛选高纯合度天麻的方法及其所用引物组合

作者：杨超月

技术特征：
1.鉴定天麻的rflp分子标记位点的试剂，其特征在于：所述rflp分子标记位点为20个snp位点，所述20个snp位点由e1标记位点、e2标记位点、e3标记位点、e4标记位点、e5标记位点、e6标记位点、e7标记位点、e8标记位点、e9标记位点、e10标记位点、e11标记位点、h1标记位点、h2标记位点、h3标记位点、s1标记位点、x1标记位点、x2标记位点、x3标记位点、x4标记位点和x5标记位点组成，所述e1标记位点是天麻3号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为t或g，为天麻基因组中seq id no.1的第435位核苷酸，所述e2标记位点是天麻7号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为a或c，为天麻基因组中seq id no.2的第392位核苷酸，所述e3标记位点是天麻1号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为g或c，为天麻基因组中seq id no.3的第360位核苷酸，所述e4标记位点是天麻2号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为c或t，为天麻基因组中seq id no.4的第409位核苷酸，所述e5标记位点是天麻2号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为c或g，为天麻基因组中seq id no.5的第171位核苷酸，所述e6标记位点是天麻8号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为t或c，为天麻基因组中seq id no.6的第313位核苷酸，所述e7标记位点是天麻17号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为a或g，为天麻基因组中seq id no.7的第280位核苷酸，所述e8标记位点是天麻2号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为c或a，为天麻基因组中seq id no.8的第347位核苷酸，所述e9标记位点是天麻3号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为a或g，为天麻基因组中seq id no.9的第140位核苷酸，所述e10标记位点是天麻4号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为g或a，为天麻基因组中seq id no.10的第333位核苷酸，所述e11标记位点是天麻5号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为g或a，为天麻基因组中seq id no.11的第330位核苷酸，所述h1标记位点是天麻5号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为c或t，为天麻基因组中seq id no.12的第194位核苷酸，所述h2标记位点是天麻14号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为c或t，为天麻基因组中seq id no.13的第460位核苷酸，所述h3标记位点是天麻14号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为c或t，为天麻基因组中seq id no.14的第133位核苷酸，所述s1标记位点是天麻10号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为g或c，为天麻基因组中seq id no.15的第387位核苷酸，所述x1标记位点是天麻1号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为a或c，为天麻基因组中seq id no.16的第350位核苷酸，所述x2标记位点是天麻5号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为a或g，为天麻基因组中seq id no.17的第288位核苷酸，
所述x3标记位点是天麻8号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为g或a，为天麻基因组中seq id no.18的第310位核苷酸，所述x4标记位点是天麻12号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为t或c，为天麻基因组中seq id no.19的第311位核苷酸，所述x5标记位点是天麻6号染色体上的一个位点，其核苷酸种类为a或g，为天麻基因组中seq id no.20的第186位核苷酸；所述试剂由名称为e1组的组合物、e2组的组合物、e3组的组合物、e4组的组合物、e5组的组合物、e6组的组合物、e7组的组合物、e8组的组合物、e9组的组合物、e10组的组合物、e11组的组合物、h1组的组合物、h2组的组合物、h3组的组合物、s1组的组合物、x1组的组合物、x2组的组合物、x3组的组合物、x4组的组合物、x5组的组合物共20种组合物组成，所述e1组由名称为e1引物对的扩增包括所述e1标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶ecorⅰ组成，所述e2组由名称为e2引物对的扩增包括所述e2标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶ecorⅰ组成，所述e3组由名称为e3引物对的扩增包括所述e3标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶ecorⅰ组成，所述e4组由名称为e4引物对的扩增包括所述e4标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶ecorⅰ组成，所述e5组由名称为e5引物对的扩增包括所述e5标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶ecorⅰ组成，所述e6组由名称为e6引物对的扩增包括所述e6标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶ecorⅰ组成，所述e7组由名称为e7引物对的扩增包括所述e7标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶ecorⅰ组成，所述e8组由名称为e8引物对的扩增包括所述e8标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶ecorⅰ组成，所述e9组由名称为e9引物对的扩增包括所述e9标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶ecorⅰ组成，所述e10组由名称为e10引物对的扩增包括所述e10标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶ecorⅰ组成，所述e11组由名称为e11引物对的扩增包括所述e11标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶ecorⅰ组成，所述h1组由名称为h1引物对的扩增包括所述h1标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶hindⅲ组成，所述h2组由名称为h2引物对的扩增包括所述h2标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶hindⅲ组成，所述h3组由名称为h3引物对的扩增包括所述h3标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶hindⅲ组成，所述s1组由名称为s1引物对的扩增包括所述s1标记位点在内的天麻基因组dna片段的
引物组合物和限制性核酸内切酶salⅰ组成，所述x1组由名称为x1引物对的扩增包括所述x1标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶xbai组成，所述x2组由名称为x2引物对的扩增包括所述x2标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶xbai组成，所述x3组由名称为x3引物对的扩增包括所述x3标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶xbai组成，所述x4组由名称为x4引物对的扩增包括所述x4标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶xbai组成，所述x5组由名称为x5引物对的扩增包括所述x5标记位点在内的天麻基因组dna片段的引物组合物和限制性核酸内切酶xhoi组成。2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述e1引物对由名称分别为e1-f和e1-r的两种单链dna组成，所述e1-f的核苷酸序列是序列表中序列1的第1-20位，所述e1-r的核苷酸序列与序列表中序列1的第691-710位反向互补，所述e2引物对由名称分别为e2-f和e2-r的两种单链dna组成，所述e2-f的核苷酸序列是序列表中序列2的第1-20位，所述e2-r的核苷酸序列与序列表中序列2的第565-584位反向互补，所述e3引物对由名称分别为e3-f和e3-r的两种单链dna组成，所述e3-f的核苷酸序列是序列表中序列3的第1-20位，所述e3-r的核苷酸序列与序列表中序列3的第571-590位反向互补，所述e4引物对由名称分别为e4-f和e4-r的两种单链dna组成，所述e4-f的核苷酸序列是序列表中序列4的第1-20位，所述e4-r的核苷酸序列与序列表中序列4的第554-573位反向互补，所述e5引物对由名称分别为e5-f和e5-r的两种单链dna组成，所述e5-f的核苷酸序列是序列表中序列5的第1-20位，所述e5-r的核苷酸序列与序列表中序列5的第395-416位反向互补，所述e6引物对由名称分别为e6-f和e6-r的两种单链dna组成，所述e6-f的核苷酸序列是序列表中序列6的第1-20位，所述e6-r的核苷酸序列与序列表中序列6的第474-494位反向互补，所述e7引物对由名称分别为e7-f和e7-r的两种单链dna组成，所述e7-f的核苷酸序列是序列表中序列7的第1-22位，所述e7-r的核苷酸序列与序列表中序列7的第439-458位反向互补，所述e8引物对由名称分别为e8-f和e8-r的两种单链dna组成，所述e8-f的核苷酸序列是序列表中序列8的第1-20位，所述e8-r的核苷酸序列与序列表中序列8的第446-466位反向互补，所述e9引物对由名称分别为e9-f和e9-r的两种单链dna组成，所述e9-f的核苷酸序列是序列表中序列9的第1-20位，所述e9-r的核苷酸序列与序列表中序列9的第382-401位反向互补，
所述e10引物对由名称分别为e10-f和e10-r的两种单链dna组成，所述e10-f的核苷酸序列是序列表中序列10的第1-22位，所述e10-r的核苷酸序列与序列表中序列10的第495-514位反向互补，所述e11引物对由名称分别为e11-f和e11-r的两种单链dna组成，所述e11-f的核苷酸序列是序列表中序列11的第1-21位，所述e11-r的核苷酸序列与序列表中序列11的第501-522位反向互补，所述h1引物对由名称分别为h1-f和h1-r的两种单链dna组成，所述h1-f的核苷酸序列是序列表中序列12的第1-20位，所述h1-r的核苷酸序列与序列表中序列12的第482-501位反向互补，所述h2引物对由名称分别为h2-f和h2-r的两种单链dna组成，所述h2-f的核苷酸序列是序列表中序列13的第1-20位，所述h2-r的核苷酸序列与序列表中序列13的第634-653位反向互补，所述h3引物对由名称分别为h3-f和h3-r的两种单链dna组成，所述h3-f的核苷酸序列是序列表中序列14的第1-20位，所述h3-r的核苷酸序列与序列表中序列14的第517-536位反向互补，所述s1引物对由名称分别为s1-f和s1-r的两种单链dna组成，所述s1-f的核苷酸序列是序列表中序列15的第1-20位，所述s1-r的核苷酸序列与序列表中序列15的第543-564位反向互补，所述x1引物对由名称分别为x1-f和x1-r的两种单链dna组成，所述x1-f的核苷酸序列是序列表中序列16的第1-20位，所述x1-r的核苷酸序列与序列表中序列16的第630-649位反向互补，所述x2引物对由名称分别为x2-f和x2-r的两种单链dna组成，所述x2-f的核苷酸序列是序列表中序列17的第1-22位，所述x2-r的核苷酸序列与序列表中序列17的第564-585位反向互补，所述x3引物对由名称分别为x3-f和x3-r的两种单链dna组成，所述x3-f的核苷酸序列是序列表中序列18的第1-20位，所述x3-r的核苷酸序列与序列表中序列18的第512-531位反向互补，所述x4引物对由名称分别为x4-f和x4-r的两种单链dna组成，所述x4-f的核苷酸序列是序列表中序列19的第1-21位，所述x4-r的核苷酸序列与序列表中序列19的第526-547位反向互补，所述x5引物对由名称分别为x5-f和x5-r的两种单链dna组成，所述x5-f的核苷酸序列是序列表中序列20的第1-20位，所述x5-r的核苷酸序列与序列表中序列20的第511-530位反向互补。3.权利要求1或2所述的试剂在如下任一中的应用，(1)鉴定或辅助鉴定天麻纯合度；(2)筛选或选育高纯合度的天麻单株或株系或品系或品种；(4)天麻育种；(5)制备鉴定或辅助鉴定天麻高纯合度的产品；(6)制备筛选或选育高纯合度的天麻单株或株系或品系或品种的产品；
(7)制备筛选或选育高纯合度的天麻单株或株系或品系或品种的产品；(8)制备天麻育种的产品。4.鉴定或辅助鉴定天麻的rflp分子标记位点的引物组合物，其特征在于：所述rflp分子标记位点为权利要求1中所述的20个snp位点，所述引物组合物由如下20种引物对组成：权利要求1或2中所述的e1引物对、权利要求1或2中所述的e2引物对、权利要求1或2中所述的e3引物对、权利要求1或2中所述的e4引物对、权利要求1或2中所述的e5引物对、权利要求1或2中所述的e6引物对、权利要求1或2中所述的e7引物对、权利要求1或2中所述的e8引物对、权利要求1或2中所述的e9引物对、权利要求1或2中所述的e10引物对、权利要求1或2中所述的e11引物对、权利要求1或2中所述的h1引物对、权利要求1或2中所述的h2引物对、权利要求1或2中所述的h3引物对、权利要求1或2中所述的s1引物对、权利要求1或2中所述的x1引物对、权利要求1或2中所述的x2引物对、权利要求1或2中所述的x3引物对、权利要求1或2中所述的x4引物对、权利要求1或2中所述的x5引物对。5.权利要求4所述的引物组合物在如下任一中的应用，(1)鉴定或辅助鉴定天麻品种纯合度；(2)筛选或选育高纯合度的天麻单株或株系或品系或品种；(4)天麻育种；(5)制备鉴定或辅助鉴定天麻高纯合度的产品；(6)制备筛选或选育高纯合度的天麻单株或株系或品系或品种的产品；(7)制备筛选或选育高纯合度的天麻单株或株系或品系或品种的产品；(8)制备天麻育种的产品。6.鉴定或辅助鉴定天麻纯合度的方法，包括如下步骤：1)分别以待测天麻的基因组dna为模板，用权利要求4所述的20种引物对分别进行pcr扩增，得到20种pcr产物，将用所述e1引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为e1-pcr产物，将用所述e2引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为e2-pcr产物，将用所述e3引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为e3-pcr产物，将用所述e4引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为e4-pcr产物，将用所述e5引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为e5-pcr产物，将用所述e6引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为e6-pcr产物，将用所述e7引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为e7-pcr产物，将用所述e8引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为e8-pcr产物，将用所述e9引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为e9-pcr产物，将用所述e10引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为e10-pcr产物，将用所述e11引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为e11-pcr产物，将用所述h1引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为h1-pcr产物，将用所述h2引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为h2-pcr产物，将用所述h3引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为h3-pcr产物，将用所述s1引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为s1-pcr产物，将用所述x1引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为x1-pcr产物，将用所述x2引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为x2-pcr产物，将用所述x3引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为x3-pcr产物，将用所述x4引物对进行pcr扩增得到的待测天麻pcr产物命名为x4-pcr产物，将用所述x5引物对进行pcr扩增得到的待测天
麻pcr产物命名为x5-pcr产物；2)将所述20种引物对的待测天麻pcr产物进行rflp分析，所述rflp分析包括将所述20种引物对的待测天麻pcr产物用限制性核酸内切酶进行酶切，得到20种酶切产物，将所述20种酶切产物进行电泳，根据电泳结果确定所述20种酶切产物的条带的数量；所述rflp分析中，所述e1-pcr产物、所述e2-pcr产物、所述e3-pcr产物、所述e4-pcr产物、所述e5-pcr产物、所述e6-pcr产物、所述e7-pcr产物、所述e8-pcr产物、所述e9-pcr产物、所述e10-pcr产物、所述e11-pcr产物均分别用限制性核酸内切酶ecorⅰ进行酶切，所述h1-pcr产物、所述h2-pcr产物、所述h3-pcr产物均分别用限制性核酸内切酶hindⅲ进行酶切，所述s1-pcr产物用限制性核酸内切酶sali进行酶切，所述x1-pcr产物、所述x2-pcr产物、所述x3-pcr产物、所述x4-pcr产物均分别用限制性核酸内切酶xbai进行酶切,所述x5-pcr产物用限制性核酸内切酶xhoi进行酶切；3)根据待测天麻所述pcr产物酶切条带的数量，计算纯合度。7.天麻育种的方法，其特征在于：所述方法包括利用权利要求6的方法鉴定或辅助鉴定天麻纯合度，选择纯合度大于等于95％的天麻作为亲本(候选亲本)进行育种，所述纯合度的计算公式为：h＝(1-n/20)
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100％，h代表纯合度，n代表所述20种pcr产物经酶切后电泳结果中出现3条带的酶切产物的种数。

技术总结
本发明公开了快速筛选高纯合度天麻的方法及其所用引物组合物。本发明所要解决的技术问题是如何筛选或辅助筛选高纯合度天麻品种。本发明提供了鉴定天麻的RFLP分子标记位点的试剂，通过检测待测天麻的RFLP分子标记位点基因型，鉴定或辅助鉴定天麻品种的纯合度；不同天麻品种基因组DNA片段RFLP位点的PCR产物酶切后凝胶电泳结果可出现不同数量的条带，选择天麻品种基因组DNA片段RFLP位点的纯合度等于大于95％为高纯合度天麻品种。将检测所述天麻基因组中RFLP分子标记位点的组合物质与其他物质(如检测其他与天麻纯合度相关的分子标记的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一起制备鉴定天麻高纯度品种产品。制备鉴定天麻高纯度品种产品。

技术研发人员：袁媛华中一赵玉洋黄璐琦
受保护的技术使用者：中国中医科学院中药研究所
技术研发日：2022.05.26
技术公布日：2022/9/2